修饰核酸/碱基

核酸修饰是调控基因表达、细胞分化及个体发育的核心表观机制。该类修饰无需改变基因固有序列,即可大幅拓展遗传信息的调控维度,赋予生命活动灵活的动态调控能力。与固定恒定的基因序列不同,核酸修饰可响应各类内外环境因素,在生物体全生命周期内持续动态变化。大量前沿研究证实,核酸修饰紊乱与多种疾病的发生发展密切相关,使其成为疾病精准诊断、发病机制研究及个体化靶向治疗的核心潜力靶点,在生物医药科研与临床转化领域具备极高的研究价值与应用前景。

核酸修饰是调控基因表达、细胞分化及个体发育的核心表观机制。该类修饰无需改变基因固有序列,即可大幅拓展遗传信息的调控维度,赋予生命活动灵活的动态调控能力。与固定恒定的基因序列不同,核酸修饰可响应各类内外环境因素,在生物体全生命周期内持续动态变化。大量前沿研究证实,核酸修饰紊乱与多种疾病的发生发展密切相关,使其成为疾病精准诊断、发病机制研究及个体化靶向治疗的核心潜力靶点,在生物医药科研与临床转化领域具备极高的研究价值与应用前景。

完整的核酸修饰科研体系包含六大核心研究环节:一是筛选构建适配研究需求的核酸修饰调控生物模型;二是通过定性、定量检测技术解析模型中核酸修饰丰度,建立修饰水平与生物学功能的关联机制;三是依托高通量测序技术,精准筛选具备功能性调控作用的靶基因;四是借助分子生物学技术验证靶基因功能,深度阐明其参与生命活动的分子机制;五是依托大规模临床样本,验证核酸修饰的临床诊断效能与治疗转化价值;六是基于筛选获得的核心核酸修饰标志物,搭建标准化的疾病诊断与治疗研发生物模型。

纵观全研究链条,精准的核酸修饰定性、定量检测是所有后续研究的核心基础与前置关键,能够提供最直接、最可靠的原始实验依据,决定后续机制研究、临床验证与模型构建的精准度。但生物样本中核酸修饰天然丰度极低,对检测技术的灵敏度、稳定性、精准度提出了极高要求,因此开发高性能的核酸修饰定性定量检测技术,是推动该领域科研突破与临床转化的关键核心。

目前,科研领域已在DNA、RNA中发现170余种功能性化学修饰,构成了表观遗传与表观转录组的核心调控体系,广泛参与基因表达、RNA稳定性、蛋白翻译、细胞分化等关键生命过程。相较于修饰类型有限的DNA甲基化修饰(5mC、5hmC等经典类型),RNA修饰的种类更为丰富、调控场景更广泛,普遍存在于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等各类RNA分子中。

其中,N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)是真核生物中丰度最高、研究最广泛的RNA修饰,占总腺嘌呤含量的0.1%~0.4%,与假尿苷(Ψ,占总尿苷0.2%~0.6%)丰度水平相近。除此之外,hm⁶A、m¹A、肌苷(I)、Am、m⁵U、Um、m⁵C、hm⁵C、m³C、Cm、m⁷G、Gm等多种RNA修饰,共同构成了复杂的RNA表观调控网络,是当前生命科学研究的热点方向。

当前行业主流的核酸修饰定量检测技术涵盖薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、毛细管电泳(CE)、GC-MS、LC-MS、表面增强拉曼光谱(SERS)、免疫分析、生物传感等多种技术体系。其中,质谱技术凭借样本适配性广、检测灵敏度超高、线性动态范围宽、结果重复性好等核心优势,可实现不同生物样本中核酸修饰的全局组学对比分析,已成为核酸修饰定性定量检测的行业金标准技术。

依托前沿质谱技术体系,我们搭建了一站式核酸修饰精准检测技术平台,可实现修饰核酸的定性、定量分析。平台双系统协同赋能:搭载高分辨精确质量(HRAM)轨道阱质谱系统,支持未知核酸修饰的广谱挖掘与全新功能修饰筛选;配置三重四极杆(QQQ)质谱平台,基于MRM/PRM精准检测模式,结合同位素标记内标法,实现靶标核酸修饰的超高精准度绝对定量。

同时,我们创新研发同位素示踪修饰核酸检测技术,可精准检测¹³C标记修饰核酸的同位素质量分布数据,突破传统检测技术局限,为核酸修饰代谢机制研究、动态调控溯源、精准靶点验证提供全方位、高可靠的技术支撑,全面赋能基础科研、机制探索与临床转化研究。



]服务流程

1. RNA的提取

采用 Trizol 试剂法或硅胶柱试剂盒从细胞、组织样本中提取总 RNA;借助生物分析仪或 TapeStation 评估 RNA 完整度(要求 RIN 值≥7),分光光度法核验纯度;通过 DNase 酶处理清除基因组 DNA 污染,避免基因组 DNA 干扰、拉高核苷检测信号造成结果虚高。

2. 酶解

先后加入酶解试剂及内标;核酸酶P1切断RNA链的磷酸二酯键,将长链mRNA剪切成单磷酸核苷,磷酸酶脱去磷酸基团,最终释放游离核苷+各类修饰核苷(m⁶A等修饰结构完整保留)。

3. 液相色谱分离

采用C18反相分析色谱柱开展分离;流动相随时间梯度变化,不同理化性质的核苷在色谱柱中迁移速率不同;通过方法优化使多种核苷依次出峰、基线分离,把混合核苷拆分为单一组分,避免多种修饰核苷共洗脱干扰质谱检测。

4. LC-MS数据采集

检测可选用两种模式:

三重四极杆质谱的多反应监测模式(QQQ‑MRM):适用于靶向定量分析;

轨道阱高分辨全扫描模式(Orbitrap HRAM):适用于广谱扫描、修饰图谱全景分析。

5. 数据分析与结果输出

修饰丰度热图:以颜色深浅展示 m⁶A、m⁵C 等多种修饰在不同样本间的丰度差异。

分组柱状图:对比不同修饰的含量水平。

图片关键词

]仪器平台

平台一:超高效液相色谱高分辨质谱联用仪(UHPLC-HRMS)Q Exactive ™ HF-X ( Thermo Scientific Orbitrap MS)

平台二:超高效液相色谱‑串联质谱联用系统(Shimadzu Nexera/Prominence LC + SCIEX Triple Quad 7500)

仪器2.jpg前端采用岛津 Nexera/Prominence LC 色谱系统,凭借优异的色谱分离能力与灵敏度,可实现复杂基质中痕量化合物的分离分析;后端配置 SCIEX Triple Quad 7500 三重四极杆质谱仪。该质谱系统具备高灵敏度与良好的抗基质干扰能力,适用于复杂样品基质下的多组分靶向定量分析,可满足环境、临床、食品以及药物微量杂质等多领域检测需求。


 ]样本量要求

样本类型

推荐送样量

已提取总RNA

10–20 μg

预备纯化 mRNA(多聚A富集型)

>1μg

纯化tRNA组分

>1μg

]RNA质量要求

总RNA:浓度≥50 ng/μL;A260/A280 ratio 1.8–2.1, A260/A230 ratio ≥ 1.8 ;

RNA完整度数值(RIN 值)≥7.0。

预纯化mRNA:需配套生物分析仪/毛细管电泳仪(TapeStation)的电泳图谱,证明多聚A富集效果合格(18S、28S核糖体RNA峰已被有效去除)。

]生物学重复设置

每组实验条件至少设置 3 个生物学重复,保障统计学分析有效性;若是时间梯度、剂量梯度类实验,建议每个时间点、每个剂量组均设置三组平行样本。

]样本前处理建议

1. RNA提取可采用Trizol试剂法,或硅胶膜吸附柱类商品化试剂盒;提取流程必须加入DNase I酶处理步骤,彻底清除基因组DNA污染。

2. RNA最终溶解于无核酸酶纯水,禁止用TE缓冲液溶解(缓冲液中的EDTA会干扰后续酶解反应)。

3. 避免样本反复冻融:将RNA分装为单次实验用量的小份储存。

]保存与运输规范

1. RNA长期储存条件:-80℃低温冷冻。

2. 运输要求:使用无核酸酶离心管盛放样本、干冰冷链寄送,干冰量需可维持48–72 小时低温环境;随货附上纸质样本登记单,标注内容包含:需备注RNA浓度、A260/A280比值、RIN值(如有检测结果)、各类样本特殊备注;寄出后同步物流单号,便于到货追踪。

 


核酸修饰RNA部分物质列表 

NORNA modification简称中文名称核酸类型
1N6‑methyladenosinem6AN6‑甲基腺苷RNA
22'‑O‑methyladenosineAm2'-O‑甲基腺苷RNA
3InosineI肌苷RNA
4N6‑isopentenyladenosinei6AN6‑异戊烯基腺苷RNA
55‑methyluridinem5U5‑甲基尿苷RNA
65,2’‑O‑dimethyluridinem5Um5‑甲基‑2'-O‑二甲基尿苷RNA
7N6,N6‑dimethyladenosinem6,6AN6,N6‑二甲基腺苷RNA
81‑methyladenosinem1A1‑甲基腺苷RNA
9N4‑acetylcytidineac4CN4‑乙酰胞苷RNA
10N4‑acetyl‑2'‑O‑methylcytidineac4CmN4‑乙酰‑2'-O‑甲基胞苷RNA
115‑hydroxyuridineho5U5‑羟基尿苷RNA
122'‑O‑methylcytidineCm2'-O‑甲基胞苷RNA
13N2,N2‑dimethylguanosinem2,2GN2,N2‑二甲基鸟苷RNA
147‑methylguanosinem7G7‑甲基鸟苷RNA
152'‑O‑methylinosineIm2'-O‑甲基肌苷RNA
161‑methylinosinem1I1‑甲基肌苷RNA
172'‑O‑methylguanosineGm2'-O‑甲基鸟苷RNA
18N6,2'‑O‑dimethyladenosinem6AmN6‑2'-O‑二甲基腺苷RNA
191‑methylguanosinem1G1‑甲基鸟苷RNA
204‑thiouridines4U4‑硫代尿苷RNA
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