]服务简介
微生物群落（菌群多样性组成谱）测序是指以细菌/古菌16S rRNA基因可变区、真菌18S rRNA基因可变区或真菌ITS（Internal transcribed spacer）内转录间隔区等微生物特征序列（Signature sequence）为靶点对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的结构（数量、丰度、种类、变异等）来分析特定环境中微生物群体中各类微生物的构成情况或其功能。继而我们可以研究分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因，阐明样本间多样性和组成差异，进而发现差异相关物种。
对微生物群落进行测序包括两类：
1. 通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；
2. 宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。
以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。
谱领生物可根据16s的测序数据结果结合已有知识将微生物群落分类到种（species）甚至对亚种级别并进行分析。
]服务优势
◆专业严谨的服务：专业成熟的样本制备、建库以及数据分析流程，客观还原样品本身的菌群结构以及丰度。
◆覆盖范围广：可覆盖更广的可变区，物种注释时的准确度和灵敏度更高。
◆强大的样本处理能力：针对大量的样本以及分组复杂的样本，具有清晰的逻辑处理思路，专业的分组对比分析能力。
◆定制化分析策略：针对客户的不同研究需求提供灵活多变的研究方案。针对客户提出的个性化分析需求，提供专业的分析服务。可定制化分析ROC曲线、Source Tracker分析、Mantel test分析等。
◆完善的售前、售后服务：经验丰富的技术支持和生物信息工程师提供研究策略指导及完善的售后服务。
]服务项目
宏基因组测序
宏转录组测序
细菌基因组de novo测序
真菌基因组de novo测序
16S/18S/ITS扩增子测序
微生物组重测序
]服务流程
]样本量要求
样本类型 | 样本量及样本要求 |
DNA样本 | DNA总量≥250ng 样本浓度≥5ng/uL 样品纯度OD260/280为1.8~2.2 DNA主带清晰无明显降解 |
检测平台：采用 Ion S5 XL 测序平台和 NovaSeq 6000 测序平台。NovaSeq 6000 测序平台通量更高，速度更快，运行时间更短，周期最短可达10天。Ion S5 XL测序平台单端测序，无需拼接，SE400/SE600 两种模式。两种平台，为扩增子测序提供更多的选择。
测序深度：PE 250 / SE400/600
服务周期：10个工作日
]服务内容
OTU分类/Venn图分析、Alpha多样性分析、分类组成分析、Beta多样性分析、菌群组成交互可视化分析、PICRUSt（KEGG/COG/Rfam）菌群代谢功能预测。
从不同分类层级的相对丰度表出发，选取出在各样品（组）中的最大相对丰度排名前 10 的物种，并将其余的物种设置为 Others，绘制出各样品对应的物种注释结果在不同分类层级上的相对丰度柱形图。
图1 物种相对丰度柱形图
从不同分类层级的相对丰度表出发，选取丰度排名前 35 的属及它们在每个样品中的丰度信息绘制热图，并从物种层面进行聚类，便于结果展示和信息发现，从而找出样品中聚集较多的物种。
图2 基因数目及丰度聚类热图
稀释曲线是从样本中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目（即OTUs数目），以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建曲线。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量接近合理，更多的数据量只会产生少量新的物种（OTUs）。
图3 稀释曲线
Alpha Diversity 用于分析样本内（Within-community）的微生物群落多样性，通过单样本的多样性分析（Alpha 多样性）可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性，包括用物种累积箱形图、物种多样性曲线和一系列统计学分析指数来评估各样本中微生物群落的物种丰富度和多样性的差异。
图4 物种累积箱形图
Beta Diversity是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。首先根据所有样本的物种注释结果和OTUs的丰度信息，将相同分类的OTUs信息合并处理得到物种丰度信息表（Profiling Table）。同时利用OTUs之间的系统发生关系，进一步计算Unifrac距离（Unweighted Unifrac）。
图5 Beta多样性指数热图
LEfSe(LDA Effect Size)是一种用于发现和解释高维度生物标识（基因、通路和分类单元）的分析工具，可以用于进行两个或多个分组的比较，它强调统计意义和生物相关性，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的Biomarker。让研究人员能够识别不同丰度的特征以及相关联的类别。LEfSe的统计结果包括三部分，分别是LDA值分布柱状图，进化分支图（系统发育分布）和组间具有统计学差异的Biomarker在不同组中丰度比较图。
图6 LDA值分布柱状图 图7 进化分支图
CCA/RDA分析主要用来反映菌群与环境因子之间的关系，可以检测环境因子、样本、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系，可得到影响样本分布的重要环境驱动因子。
图8 CCA分析图
相关文献
Perruzza L, Gargari G, Proietti M, et al. T Follicular Helper Cells Promote a Beneficial Gut Ecosystem for Host Metabolic Homeostasis by Sensing Microbiota-Derived Extracellular ATP. Cell Rep. 2017;18(11):2566-2575.
