蛋白组定性

研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)和 TMT(Tandem Mass Tags)分别是由美国 AB Sciex 公司和 Thermo 公司研发的多肽体外标记定量技术,是目前广泛运用的两种标记定量蛋白质组技术,分别通过与氨基酸末端氨基以及赖氨酸残基的游离氨基结合,实现对多肽的标记,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量,并通过不同分子量的试剂对不同来源样品进行标记,实现不同样品间蛋白质组比较的目标。

蛋白质组定性

蛋白定性通常是基于液质联用(LC-MS/MS)的鸟枪法蛋白鉴定,是基于自上而下(Bottom Up)的分析手段,样本类型通常是SDS-PAGE胶或者IP Pulldown 溶液;该方法适合于对蛋白进行全局定性分析,判断蛋白有无并提高了鉴定低丰度目标蛋白的可能性。


  服  务  优  势  

♕ 高精度与准确性:采用高分辨质谱仪,上机时间120min,更高的覆盖率;

♕ 实验易操作性和灵活性:可根据实验目的选择不同的送样形式,可对不同的蛋白序列采取不同的胰酶酶切方式;

♕ 快速看差异蛋白:可快速低成本定性分析不同溶液,组织等差异蛋白;

♕ 目的性强:可结合免疫共沉淀实验,即AP-MS,找寻靶向结合蛋白;

♕ 分析多肽成分:除蛋白成分之外,未知的多肽组分,也可通过溶液质谱进行分析。



  服  务  流  程 

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胶条质谱鉴定






技术参数


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数据分析


基于质谱检测得到的Raw文件,进行对应数据库的搜索,然后基于数据库搜索的结果进行蛋白质鉴定,同时进行肽段、蛋白和母离子质量容差分布分析,谱检测数据的质量。然后对鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释,包括COG、GO和KEGG数据库。信息分析流程如下图:

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结果展示


GO功能注释

 

COG功能注释



 

KEGG功能注释

 

结构域注释


 典 型 案 例  

通过绿藻膜蛋白质组学进行的绿藻生理机能与分类研究

Membrane proteomic insights into the physiology and taxonomy of a green microalga

期刊:Plant Physiology
影响因子:6.454
发表单位:墨西哥国立自治大学、南十字星大学
发表时间:2017.01




研究背景


Ettlia oleoabundans 是一种未被测序过的产油绿色微藻,尽管利用这种微藻的酰基脂质加工化合物具有显著的生物价值,但是我们对于Ettlia oleoabundans的生理学与生物化学缺乏最本的理解,特别是氮缺乏状况下的脂质积累过程。本研究使用基于RNA-Seq的蛋白质组学方法,配合手工注释,首次报道了Ettlia oleoabundans的膜蛋白质组。利用此方法,首次鉴定到了几种新发蛋白,并证明LC-MS技术与电泳技术相结合可用于确定目标蛋白的细胞内定位。



研究方法


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研究结果



1. Ettlia oleoabundans膜蛋白质组

本文使用基于RNA-Seq的蛋白质组学策略,利用从头测序产生的转录组数据作为指导,组建包含54,652条非冗余预测蛋白质序列的 E.oleoabundans蛋白质数据库。将 E.oleoabundans蛋白质数据库与Viridiplantae 蛋白库进行合并后搜库,共鉴定到551种蛋白质 (18,902个谱图),其中404种蛋白在4个生物学重复 中的至少2个鉴定到。与仅使用Viridiplantae数据库相比,这个数字增加了13.5倍。

2. 发现几种新发蛋白,并通过质谱分析,确定了其细胞定位

本研究对 E.oleoabundans中新发现的光合作用蛋白PSBS(图 1)和MPH1(图2)进行了鉴定。PSBS和MPH1蛋白之前被认为是高等光合作用生物所特有的。除了与光合作用相关的蛋白外,本研究还检测到RP2-CLC蛋白,这是一种新型的结构域蛋白,可能参与低等真核生物中网格蛋白包裹的囊泡细胞内运输 过程。本研究还证实PSBS和MPH1存在于叶绿体,而RP2-CLC 存在于细胞膜(图3)。

3. 膜蛋白质组功能注释,重新确定了 E.oleoabundans的系统分类学地位

E.oleoabundans目前被归属于绿藻纲,不过本项研究发 现的92%的蛋白质与共球藻纲类物种具有同源性,而仅有 3%的蛋白与绿藻纲类同源。而且对于特异蛋白PSBS、 MPH1、TBCC、RP2-CLC的系统进化分析也显示, E.oleoabundans与C.variabilis(共球藻纲)的亲缘关系 比与绿藻纲更近。

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研究结论


本研究针对产油微藻的膜蛋白质组学进行了详细的研究。利用基于RNA-Seq的蛋白质组学策略,共鉴定到551种蛋白质,其中404种蛋白在4个生物学重复中的至少2个都鉴定到。现2种与光合作用相关的新发蛋白PSBS和MPH1。另外还检测到1种新型的结构域蛋白RP2-CLC,预测其可能参与囊泡的细胞内运输。对于膜蛋白质组的功能注释重新确定了E.oleoabun- dans与共球藻纲亲缘性更近。


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