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研究背景

调查数据表明，冠状动脉疾病（CAD）仍然是全球死亡的主要原因。根据2013年Global Burden of Disease（GBD）研究，每年全世界死于CAD的有814万人(16.8%)，如果CAD的分子机制能够被破译，它的发生和关联死亡率可能会降低很多，本文就代谢途径紊乱对不同类型CAD的诊断价值进行了研究。主要包括对非阻塞性冠状动脉粥样硬化(NOCA)、稳定型心绞痛(SA)、不稳定型心绞痛(UA)、急性心肌梗死(AMI)的研究。

材料与方法

本文代谢组学研究分为两个阶段：第一阶段是生物标志物发现，这项研究涉及2324名疑似心脏病患者，包括发现阶段和验证阶段。研究人员将冠心病的不同阶段与正常冠状动脉进行比较，确定和表征特定的代谢物和代谢途径。本文重点研究了NOCA与NCA对斑块形成的影响，SA与NOCA对斑块生长的影响，UA与SA对冠状动脉稳定性向不稳定性过渡的影响，以及AMI与UA的关系。研究路线（如图1）所示。

图1  代谢组学实验设计研究方案

样本处理方法

样本收集与储存：将患者的血样储存在K2 EDTA真空管中，同时，在冷冻室（4°C）中冷却。然后在3000×g的条件下离心10分钟，在2小时内于4°C分离上清液，并转移到新的小瓶中，然后立即冷冻保存（-80°C），直到样品制备。

样本制备与检测：取150μl乙腈加入50μl的血浆，将混合物旋转10秒。然后，在4℃下，对混合物进行离心分离。以13000r/min的转速离心10分钟。之后，将150μl上清液转移到洁净管中，并在室温下在温和的氮气气流下干燥。最后，用100μl水/乙腈（4:1）溶液（含0.1 mg/ml L-2氯苯丙氨酸为内标））溶解上清液。以1μl进样用于UPLC-Q/TOF-MS分析。

生物标志物的发现及鉴定

研究人员采用LC-MS技术对血浆样本进行高通量、高覆盖代谢组学数据采集，同时结合生物信息学进行数据挖掘。

从近2000个代谢物中，研究人员发现、鉴定了与冠心病发生发展密切相关的差异代谢物共89个，扰动的代谢通路主要包括磷脂代谢降低、多不饱和游离脂肪酸升高、氨基酸代谢升高、肉碱代谢升高、胆汁酸代谢减弱等（见图2）。

图2   冠心病不同临床分型的差异代谢物及关联网络

具体的组间差异代谢物的变化为E:NOCA与NCA之间，甘油磷脂、嘌呤和鞘脂类的代谢发生了变化F:SA和NOCA，甘油磷脂，缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，初级胆汁酸生物合成，精氨酸-脯氨酸G:UA和SA，甘油磷脂，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸，精氨酸-脯氨酸H：AMI和UA，甘油磷脂，鞘磷脂和精氨酸脯氨酸（见图3）。

图3   紊乱的代谢通路在比较组间时表现出不同的代谢物变化

从下图（图4）中，可以看出，肠道微生物代谢增加，胆碱及和它的代谢产物三甲胺(TMA)和三甲胺n -氧化物(TMAO)升高。磷脂合成和分解代谢受到抑制，表现为磷脂酰甘油(PGs)、磷脂酰胆碱(PCs)、磷脂酰乙醇胺(PEs)和磷脂酰肌醇(PIs)的减少。鞘氨酸的代谢产物显著升高，表明鞘磷脂代谢增强。SCAs水平的升高表明肉碱酸和脂肪酸代谢水平显著升高。琥珀酸、富马酸和苹果酸等中间体呈下降趋势，表示三羧酸(TCA)循环的抑制作用。几种氨基酸代谢途径被激活：具体包括苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和脯氨酸等。乙氧基去氧胆酸(ECDCA)和糖胆酸(GCA)水平显示初级胆汁酸生物合成受到抑制。

图4   紊乱的代谢通路相关联系图

生物标志物的验证及临床诊断价值的评估

基于ROC在发现阶段的最高预测灵敏度和特异性，NOCA与NCA的最佳截断值为0.635，SA与NOCA的最佳截断值为0.205，UA与NCA的最佳截断值为0.692。AMI和UA分别为0.475和0.475。然后使用截止值来预测CAD在测试阶段和外部集的不同阶段。在测试阶段，NOCA与NCA的预测值分别为95.0%和91.5%(图5E)；测试阶段SA与NOCA的比例为94.5%，验证集为89.7%(图5F)；在测试阶段，UA和SA分别为91.8%和96.4%验证集(图5G)；在测试阶段AMI和UA分别为96.0%和85.3%(图5H)（见图5）。

图 5   生物标记物临床诊断价值的评估

本研究对4个独立中心的2324名患者进行了全面的代谢组学评估。表明冠心病患者与非冠心病患者以及冠心病类型之间存在显著的模式差异。血浆样本中有89种代谢产物受到显著调控，这些变化表明冠心病可能涉及一种普遍的代谢紊乱。冠心病进展过程中磷脂分解代谢和三羧酸循环减少，氨基酸代谢和短链酰肉碱增加，初级胆汁酸生物合成下降。代谢生物标志物的组合提供了很好的预测价值，从正常冠状动脉到另一种CAD类型。无冠状动脉疾病组的335名(14.4%)参与者经历了心绞痛样胸痛和不适，但经血管造影证实动脉正常。与这一组进行比较，可以区分症状混淆的患者。冠状动脉阻塞程度与冠状动脉粥样硬化程度呈正相关。而对于CAD的严重性。所有NOCA患者均<50%。据计算，63.2%的SA、61.8%的UA和71.4%的AMI患者出现阻塞的概率小于70%。相比之下，只有一小部分UA或AMI患者的阻塞小于50%。

所以，研究人员又以显著性CAD (NCA/NOCA)与非显著性CAD (SA/UA/AMI)为例，对其特异性代谢途径进行了表征。代谢物发生显著变化，用于鉴别诊断。在发现阶段敏感性为83.3%，特异性为91.6%，在测试阶段预测值为93.0%，在外部验证集中预测值为100.0%。见（图6）。

图6  中心插图代谢组学特征和CAD类型的鉴别诊断

结论

1、研究人员创建了一个全面的代谢组学评估方法，以确定在CAD中临床相关的干扰循环代谢物。

2、这一评估提高了对CAD发病机制的认识，并有助于用于筛选治疗介入的靶点。

3、作为新型生物标志物预测和区分CAD类型一种方法，这种方法可以减少不必要的冠状动脉造影，提高预测价值，并补充目前的诊断方式。

原文链接戳：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0735109716345296?via%3Dihub