通过代谢组学技术了解芽孢杆菌B006表面素的产生机制
近年来，代谢组学的研究变得如火如荼，但是到底如何应用代谢组学技术来为自己的科研服务呢？今天小编为大家分享一篇关于“代谢组学技术在发酵方面的应用”的文章。
摘要
芽孢杆菌B006可通过有效定植和产生表面素发挥生物防治剂的作用，为了揭示表面素的产生机理，采用气相色谱-质谱联用非靶向代谢组学方法，对工业培养基M3和M4中生长的B006菌株进行了代谢产物比较，探索与表面素生物合成相关的候选代谢物。有助于了解菌株B006的代谢机制及其工业上表面素生产的发酵优化。
前言
芽孢杆菌抑制土传植物病原菌的两个重要机制是根际定植和脂肽的产生。表面素是根际和植株中检测到的三种最重要的脂肽之一，并由7个氨基酸(l-亮氨酸-d-亮氨酸-l-天冬氨酸-l-缬氨酸-d-亮氨酸-l-亮氨酸-l-谷氨酸)与12-16碳脂肪酸的羧基和羟基结合而成，表面素具有较强的生物表面活性，具有较强的抑制植物病害的能力，对人体和环境具有较低的毒性，因此得到了广泛的研究。与其他通过靶向蛋白质合成或DNA复制来抑制真菌生长的杀菌剂不同，表面素通过物理化学作用通过细胞膜破坏或解体来抑制细菌生长或通过促进有益菌的定植和诱导全身抗性来抑制真菌，然而，表面活性剂生产成本高，限制了其在农业上的商业应用。
之前有研究表明，工业培养基M3有利于菌株B006的孢子形成，而培养基M4有利于表面活性剂生产，这些培养基如何影响菌株B006的代谢是一个非常有趣的问题。本研究采用气相色谱-质谱联用技术进行非靶向代谢组学研究芽孢杆菌B006菌株表面素产生的机制，系统的揭示潜在的关键代谢产物及其相关的生物途径，并提出了可能的代谢途径。
材料与方法
B006菌株培养
将芽孢杆菌B006分别在M3和M4培养基中进行培养，其中M3培养基包含17.5 g /l玉米淀粉，5.25 g /l蔗糖，14.0 g /l豆饼粉，5.25g /l CaCO3，M4培养基包含10.0 g /l牛肉提取物，15.0 g /l玉米粉，3.0 g /lNaNO3和3.0 g /l氯化钠，芽孢杆菌B006培养56h，从8h开始每隔4h取1ml发酵液，在显微镜下计数细菌细胞数量和产孢率，采用油分散法测定表面素产量，采用高效液相色谱-电喷雾串联反应法测定了表面活性剂的最终收率，过与标准表面活性剂的保留时间和质谱比较，利用MassLynx软件计算色谱图中相对峰面积，确定了表面活性剂的总量和组成。
GC-MS的样品制备
培养B006菌株16h后，每个样本取20 mL菌液，每组7个生物学重复，放入50 mL离心管中。将离心管放置在液氮中1秒，然后立即摇动试管以避免冷冻。重复此过程10次，等试管冷却至9℃，3380g离心2 min，0.9%NaCl洗涤三次，液氮冷冻，- 80℃保存至使用。
GC-MS
采用美国安捷伦公司的气相色谱质谱联用仪（型号7890A/5975C）和德国MACHEREY-NAGEL公司 OPTIMA® 5 MS Accent熔融硅毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25μm）对衍生的酸奶样本进行代谢组学检测分析。载气为高纯（纯度大于99.999%）氦气，流速1毫升/分钟。采用梯度升温程序对样本进行分离分析。梯度升温程序为：起始炉温为70℃并维持2分钟，以6℃/分钟升到160℃，继续以10℃/分钟升到240℃，以20℃/分钟升到300℃并维持6分钟。以无分流模式进样1微升，溶剂延迟时间设定为6分钟。进样口、传输线和电子碰撞（EI）电离源温度分别设定为250℃、260℃和230℃。EI能量设定为70电子伏。采用全扫描方式对质荷比(m/z)范围为50-600的数据进行采集。（此代谢组学实验由本公司负责完成）。
数据处理
参照文献方法(Gao et al. 2010)对GC-MS原始数据进行峰提取、峰对齐、反卷积分析和进一步处理，最终数据输出为包含观察量（样本名）、变量（保留时间-质荷比）和积分面积的excel数据文件。然后在excel软件中对峰面积数据进行面积百分比归一化处理。为了消除样本制备和GC-MS分析造成的系统变异，采用质量控制（QC）样本对数据进行校正。
PCA和OPLS-DA分析
根据细胞提取物的色谱分析表明，不同培养基对细胞内代谢物的组成和丰度有显著影响 如图1所示；
通过PCA得分图（Scores plot）如图2所示。PCA得分图显示M3组和M4组之间有分离，因此PCA得分图揭示CK和K25-1组两组样本之间有代谢差异, 结果表明，B006菌株在M3和M4培养基中生长产生不同的代谢产物。
结果与讨论
B006菌株的生理特性
在培养基M3和M4中分别生长16 h后，如图3（a、b）中 B006细胞密度相似，然而，M3培养基中一些细胞开始形成内生孢子（红色箭头所示），而M4培养基中确没有，结果表明，不同培养基组成对B006菌株的生理特性有明显影响。
采用油分散法对生长在不同培养基中的菌株B006的表面素产生的能力进行了初步评价，如图1c所示，在两种培养液中孵育16 h后，油的分散直径均呈增加趋势，但在孵育40 h后均呈下降趋势，因此在16 h时采集样品进行代谢组学分析。与M3培养基相比，M4培养基更有利于表面素的产生，在24-56 h的时间内，M4培养基的表面活性剂产量为M3培养基的2倍以上。
细胞内差异代谢物的鉴定
将色谱保留时间和质谱比对数据库，共筛选并定性出78个差异性物质，在M4组观察到的44个代谢物上调，包括14个氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸)及其衍生物，四种核苷酸(腺嘌呤、肌苷、鸟苷和黄嘌呤) 两种有机酸(延胡索酸和琥珀酸)和1,3-二羟基丙酮，可能与表面素的产生密切相关； 相比之下，M3组中有7种代谢物是上调的，并可能是促进了菌株B006的内生孢子的形成。详见表1。
代谢通路分析
通过图4可以看出，在差异代谢途径中，氨基酸代谢途径和氨酰基-tRNA合成途径对表面素的合成有显著性影响，众所周知，氨酰基-tRNA负责将氨基酸运输到核糖体用于合成肽链，与氨基酸的生物合成有重大关联，因此，它在M4组中的上调是提高表面素含量的关键因素，在以往的研究中，表面素的三种结构氨基酸(亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和三种非结构氨基酸(赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸)可作为表面素结构氨基酸的前体或中间体的来提高表面素的产量。
在这项研究中,除了上述氨基酸外,其他九个氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)和衍生物在M4组都是上调的，可能与表面素合成密切相关。进一步通路分析提示天门冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸可能作为表面素结构氨基酸的前体或中间体，从而提高表面蛋白的产量。
TCA循环中延胡索酸和琥珀酸表达上调，可能通过丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢促进表面素的生成。
小结
综上所述，这篇文章用代谢组学的方法研究了芽孢杆菌B006在两种工业培养基中产生表面素的代谢机制。研究发现，丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸、精氨酸/脯氨酸和谷胱甘肽的代谢，以及缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸的生物合成与表面素的产生密切相关，这些氨基酸及其衍生物可能作为表面素结构氨基酸的前体或中间体。在TCA循环中，琥珀酸与表面素的产生也有密切联系。该研究首次揭示了B006菌株表面素合成的代谢途径，并探索了与表面素生物合成密切相关的候选代谢物。有助于了解菌株B006的代谢机制及其工业上表面素生产的发酵优化。
通过学习这篇文章，我们发现原来代谢组学不仅仅是可以为科研领域服务，工业生产领域竟然也可以用到这门技术。
文献出处：Insight in o the surfactin production of Bacillus velezensis B006 through metabolomics analysis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2018) 45:1033–1044,
https://doi.org/10.1007/s10295-018-2076-7
