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01 文章导读

长期以来，细胞如何生成并利用高能量的PEP分子，一直是代谢领域的基础科学问题。在糖异生和甘油异生过程中，PEP可通过两条途径合成：一条是胞质途径，由胞质型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK1，亦称C-PEPCK）催化；另一条是线粒体途径，由线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK2，亦称M-PEPCK）催化。过去的研究多聚焦于PCK1，尤其是其在肝脏糖异生中的作用。相比之下，PCK2虽在胰腺β细胞和脂肪组织中也有高表达，但其生理意义仍不清晰，特别是它在线粒体内生成的PEP如何被运送到胞质中参与合成代谢，一直是个悬而未决的关键问题。

由于线粒体内膜对大多数代谢物具有高度不通透性，PEP从线粒体输出必须依赖特定的载体蛋白。2026年3月17日，哈佛医学院 Shingo Kajimura 团队在《Cell》发表题为“Mitochondrial control of glycerolipid synthesis by a PEP shuttle”的研究论文，首次成功鉴定出SLC25A35是线粒体内膜上的PEP转运蛋白，从而填补了线粒体代谢物转运网络中的关键空白。

02 研究内容及结果

1. 参与PEP合成的线粒体载体蛋白

首先，作者通过同位素示踪实验证实，在白色与棕色脂肪细胞的线粒体中，13C3-丙酮酸主要代谢生成M+3标记的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）；这一结果表明，经丙酮酸→草酰乙酸→PEP 的 “丙酮酸-PEP 旁路”，是脂肪细胞线粒体合成 PEP 的核心途径，且该过程存在显著的细胞类型选择性。线粒体基质内生成的PEP，是如何跨越线粒体内膜转运至胞质的？线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK2）是脂肪细胞中PEP合成的关键主导酶，PCK2敲除会显著损伤脂肪细胞的甘油酯合成能力，线粒体中可能存在尚未被鉴定的PEP输出载体。

为鉴定该候选载体，研究团队采用了三个策略进行筛选：①可高效生成M+3标记PEP的白色、棕色脂肪细胞中高表达的线粒体载体基因；②与脂肪合成关键酶编码基因Acaca、Fasn的表达水平呈显著正相关的载体基因；③被脂肪生成刺激剂（如 PPARγ 激动剂）诱导表达的载体基因。SLC25A35与已知的柠檬酸载体SLC25A1共同被锁定为候选靶蛋白。进一步分析显示，SLC25A35在脂肪组织中高表达，且与高脂质合成能力的脂肪细胞亚群共定位。最后，通过高分辨率显微镜和蛋白水解酶保护实验，证实SLC25A35蛋白特异性定位于线粒体内膜，这为其作为PEP输出载体的功能提供了关键的细胞定位基础。

2. SLC25A35是线粒体PEP外流的必需蛋白

作者通过敲除SLC25A35的脂肪前体细胞，其分离线粒体中PEP、NAD+和1,3-二磷酸甘油酸等代谢物水平显著升高，而全细胞水平变化不大；计算线粒体富集度发现，PEP在线粒体内的积累最为显著（达9.4倍）。同位素示踪实验进一步显示，敲除细胞的线粒体中积累的PEP主要是由丙酮酸经丙酮酸羧化酶和PCK2新合成的PEP M+3，且其积累呈时间依赖性，而丙酮酸通过TCA循环氧化的活性未受影响。最关键的是，作者建立了一个直接测量线粒体PEP输出的实验系统，发现正常线粒体能随时间主动向培养基中分泌13C标记的PEP，而敲除SLC25A35的线粒体此分泌能力大幅下降。这些数据共同表明，SLC25A35的缺失导致由PCK2在线粒体内新合成的PEP因无法输出而积累，从而直接证明了SLC25A35介导了线粒体PEF的主动外排。

3. SLC25A35介导的PEP转运功能重构

作者利用杆状病毒系统表达并纯化了小鼠SLC25A35-TwinStrep融合蛋白，并将其成功插入脂质体膜中。实验结果表明在预载未标记PEP的SLC25A35脂质体中，13C标记PEP的转运活性显著高于空载体对照组，且该转运可被过量未标记PEP完全抑制，证实了SLC25A35对PEP的特异性转运。进一步的底物竞争实验揭示，除PEP外，草酰乙酸（OAA）、苹果酸和琥珀酸也能部分抑制13C-PEP的转运，提示这些三羧酸循环中间产物可能是SLC25A35的潜在低亲和力底物；而富马酸、α-酮异戊酸（KIV）和α-酮异己酸（KIC）则无竞争效应。

值得注意的是，在酸性pH条件下（模拟高线粒体膜电位状态），SLC25A35介导的PEP转运活性显著增强。这一结果提示，线粒体内膜两侧的质子梯度（即膜电位）可能是驱动SLC25A35进行PEP逆向转运的重要能量来源。

4. SLC25A35介导PEP转运的结构机制解析

利用AlphaFold预测的人源SLC25A35结构显示其具有溶质载体典型的六次跨膜通道，腔内富含保守的极性/碱性氨基酸。分子对接与动力学模拟表明，PEP能稳定结合于该空腔，其磷酸基团与Q73、R276形成氢键/盐桥，羧酸基团与R175、Y124、Y72相互作用，结合自由能为-26.58 kcal/mol。功能实验发现，单点突变体Y124A和R175A的PEP转运活性与野生型相似，而双突变体Y124A/R175A和三突变体Y124A/R175A/R276A的转运活性反而更高，这可能类似于其他SLC25载体中“盐桥网络削弱导致门控泄漏”的机制。这些结果共同证实了Y124、R175和R276是SLC25A35介导PEP转运的关键功能残基。

5. SLC25A35介导的PEP转运是脂肪组织甘油异生的必需环节

在脂肪细胞中，Slc25a35敲除会使13C3-丙酮酸示踪的13C标记GA3P/DHAP水平显著降低 77.2%，同时显著下调分化脂肪细胞与前脂肪细胞中的G3P含量。Slc25a35敲除的脂肪细胞在基础状态和胰岛素刺激条件下，同位素向脂质的掺入量均较对照细胞显著下降，细胞总甘油三酯含量也降低31.2%，且PCK1过表达无法回补该甘油三酯下降表型，Slc25a35与Pck2双敲实验进一步证实，敲除Slc25a35引发的甘油异生减弱，依赖于PCK2介导的线粒体源PEP合成，而非细胞总PEP池的变化；在此基础上构建的脂肪组织特异性Slc25a35敲除小鼠，在热中性环境高脂饮食喂养下，雄性小鼠18周龄后体重增长显著放缓，该差异源于腹股沟、附睾白色脂肪及肩胛间棕色脂肪的组织重量降低、脂肪细胞体积减小，且该表型与全身能量消耗、摄食、自主活动、脂肪组织脂解及葡萄糖氧化均无关联，同时小鼠脂肪组织中14C葡萄糖向甘油酯甘油骨架的掺入量显著降低，而向脂肪酸部分的掺入无显著差异。研究明确了 SLC25A35通过介导线粒体PEP的胞质输出，支撑脂肪组织的甘油异生过程，为甘油酯合成提供必需的甘油骨架G3P，是脂肪组织甘油酯合成的关键调控机制。

6. 阻断线粒体PEP外流可改善肝脂肪变性

通过构建肝脏特异性敲除（Slc25a35Liver KO）或使用腺相关病毒（AAV）诱导性敲除SLC25A35，作者发现，阻断该通路能显著减轻小鼠肝脏的脂肪变性：肝脏重量、甘油三酯含量、脂滴面积以及包括甘油三酯、二酰甘油、磷脂在内的多种脂质物种均显著减少，同时伴随血清和肝脏中甘油水平下降。这种脂质堆积的缓解还带来了代谢益处的连锁反应——肝脏巨噬细胞浸润和炎症基因表达减少，全身胰岛素敏感性提高，肝脏损伤标志物（ALT/AST）水平下降。重要的是，原代肝细胞实验表明，SLC25A35缺失并不影响糖异生，说明其作用特异于甘油酯合成通路。综上所述，靶向SLC25A35介导的线粒体PEP输出，能够选择性地抑制肝脏病理性脂质合成，从而缓解脂肪肝及其相关的炎症和胰岛素抵抗，展现出潜在的治疗前景。

03 研究结论

1.鉴定关键转运蛋白

首次发现并证实SLC25A35是线粒体内膜上负责将PEP从线粒体基质转运到细胞质的特异性载体蛋白。它通过依赖线粒体膜电位（质子梯度）的方式主动输出PEP，像一个受能量状态调控的“分子阀门”。

2.揭示全新代谢通路

阐明了“线粒体PEP穿梭”机制：在线粒体内，丙酮酸通过PCK2途径生成PEP，然后由SLC25A35运出，为胞质中的甘油异生提供关键的甘油骨架前体。

3.确立重要治疗靶点

SLC25A35在肥胖和脂肪肝状态下表达上调。通过基因敲除或抑制其功能，可以选择性减少甘油三酯合成，有效缓解甚至逆转肝脏脂肪变性，同时改善全身胰岛素抵抗，且不损害肝脏的基础代谢功能或引发明显毒性。这使其成为治疗代谢相关脂肪性肝病（MASLD）和2型糖尿病的极具潜力的全新药物靶点。

该研究解开了一个长期未明确的代谢谜题，不仅重新定义了线粒体在脂质合成中的主动角色，还为代谢性疾病的精准治疗开辟了全新的方向。