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01 文章导读

三羧酸（TCA）循环是进化高度保守的核心代谢通路，其核心功能在于通过偶联营养氧化与代谢物供给，驱动氧化磷酸化为细胞供能。自1937年Krebs发现该循环以来，大量研究揭示其代谢流具有显著灵活性与可塑性，颠覆了传统线性运转的认知。现有证据表明，细胞可依据内外环境的特异性需求，动态调用TCA循环的不同功能，以维持ATP之外多种关键代谢物的稳态。这种代谢异质性亦体现于相关基因缺陷所导致的疾病表型差异中。然而，目前对于TCA循环各节点所支撑的特异性细胞功能，仍缺乏系统性解析。

2026年2月27日，纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）Lydia W.S. Finley团队在《Cell》期刊在线发表题为“Citrate clearance is a major function of aconitase 2 in the canonical TCA cycle”的研究论文，聚焦于TCA循环的哪些功能输出对维持细胞适应性至关重要。

02 研究内容及结果

1.线粒体呼吸激活经典三羧酸（TCA）循环

作者通过[U-¹³C]葡萄糖示踪实验，发现非小细胞肺癌（NSCLC）细胞在相同培养条件下，苹果酸m+2与柠檬酸盐m+2的比例（mal+2/cit+2）存在差异，且该比例与电子传递链（ETC）相关基因表达正相关，氧消耗也与该比例相关，表明线粒体呼吸与经典TCA循环中的碳保留相关。为明确氧消耗与经典TCA循环通量的因果关系，用复合物I抑制剂苯乙双胍（phenformin）滴定ETC通量，结果显示随苯乙双胍处理，柠檬酸盐m+2标记和线粒体氧消耗下降，mal+2/cit+2比例呈剂量依赖性降低；而使用线粒体质子载体解偶联剂（FCCP，通过破坏线粒体内膜质子梯度抑制氧化磷酸化过程）增加ETC电子流，可增强cit+2标记并提高mal+2/cit+2比例，且苯乙双胍可逆转FCCP触发的mal+2/cit+2增加，说明葡萄糖碳进入TCA循环及在TCA循环中的保留依赖于ETC的电子流。通过在线粒体表达NADH氧化酶（mitoLbNOX）实现非ETC依赖的NAD⁺再生，同样可增强葡萄糖来源碳进入TCA循环并提升mal+2/cit+2比值。结果表线粒体NAD⁺再生不仅决定葡萄糖来源碳进入TCA循环的效率，更直接驱动碳骨架在经典TCA循环中的保留。

2. 丙酮酸氧化对三羧酸循环碳保留的调控作用

多种TCA循环酶需要NAD⁺作为关键辅助因子，丙酮酸脱氢酶（PDH）不仅以NAD⁺为辅助因子，还受NAD⁺调控的PDH激酶（PDKs）磷酸化影响。复合物I抑制剂苯乙双胍可增加NSCLC细胞系中PDH的磷酸化，而表达mitoLbNOX可减少其基础磷酸化并阻止苯乙双胍诱导的磷酸化，维持PDH活性。用二氯乙酸抑制所有PDKs可增加mal+2/cit+2比例，抑制线粒体丙酮酸载体（MPC）减少丙酮酸进入线粒体则降低该比例，且PDK1表达与mal+2/cit+2比例显著负相关，编辑PDK1可增强PDH活性，提高mal+2/cit+2比例并增加线粒体氧消耗。阻断NAD⁺再生时，PDK1缺陷型细胞仍能维持mal+2/cit+2比例，表明持续的PDH通量足以维持经典TCA循环活性。启动经典TCA循环中柠檬酸盐分解代谢的乌头酸酶2（ACO2）具有高度可逆性，平衡常数有利于柠檬酸盐生成。研究发现总柠檬酸盐水平与经典TCA循环活性相关，增加经典TCA循环使用的干预措施（如mitoLbNOX表达、PDK1缺失、添加丙酮酸）可增加柠檬酸盐池，表明线粒体NAD⁺再生将丙酮酸氧化为柠檬酸盐，最终推动碳在完整TCA循环中的捕获和保留。

3. ACO2通过清除柠檬酸维持细胞适应性

常规培养下细胞经典TCA循环活跃度低，敲除ACO2对NSCLC细胞的柠檬酸水平和增殖仅有微弱的影响；而补充丙酮酸可显著提升线粒体柠檬酸生成与TCA循环活性，此时ACO2缺失会造成柠檬酸大量堆积，使肿瘤细胞及正常细胞均出现显著的生长缺陷，该效应依赖于线粒体丙酮酸的转运。进一步研究证实，ACO2缺失引发的细胞损伤并非源于其下游TCA循环功能缺失，敲除柠檬酸合酶（CS）阻断线粒体柠檬酸生成，可完全逆转ACO2缺失细胞的柠檬酸堆积与生长缺陷，长期竞争实验也验证ACO2通过避免柠檬酸过量堆积维持细胞适应性。机制上，柠檬酸堆积可抑制糖酵解，而促进线粒体柠檬酸外运、增强胞质柠檬酸分解代谢，均可缓解ACO2缺失带来的增殖缺陷，最终明确ACO2的核心功能是清除线粒体柠檬酸、防止其有害累积，进而维持细胞的适应性与增殖能力。

4. 柠檬酸积累激活整合应激反应

为探究柠檬酸积累的影响，研究人员检测了ACO2缺陷细胞的线粒体功能，发现即使存在外源性丙酮酸，ACO2缺失也未对线粒体质量、膜电位或耗氧量产生可重复的影响。进一步RNA测序显示，通过基因集富集分析表明，与整合应激反应（ISR）相关的基因集持续富集，且ISR相关基因是丙酮酸处理的ACO2缺陷细胞中诱导最显著的基因之一，这种诱导作用可被CS缺失逆转。ISR由真核起始因子2α亚基（eIF2α）磷酸化启动，进而通过抑制三元复合物组装减少全局mRNA翻译，并选择性翻译激活转录因子4（ATF4）等转录本；与ISR激活一致，eIF2α仅在丙酮酸处理的ACO2缺陷细胞中发生磷酸化，且该细胞的全局翻译显著降低，这一表型可通过CS共缺失完全挽救，且翻译减少在丙酮酸添加数小时内开始，与细胞内柠檬酸峰值同步，并可持续长达48小时；嘌呤霉素类似物O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）的掺入在丙酮酸处理的ACO2缺陷细胞中也同样减少。

此外，丙酮酸处理可增加ACO2缺陷细胞中ATF4蛋白的表达，而这种诱导作用可通过CS共缺失或SLC25A1过表达逆转，这些数据共同表明线粒体柠檬酸积累与ISR激活相关。总体而言，丙酮酸补充对细胞活力无明显影响，但会降低细胞增殖能力，这种增殖减少与S期和G2/M期细胞减少、G1期细胞积累相关，且可通过CS共缺失完全逆转，丙酮酸对ACO2缺陷细胞周期进展的影响可通过翻译延伸抑制剂环己酰亚胺处理模拟。综上，线粒体中柠檬酸生成超过清除量会触发ISR激活、全局翻译起始抑制，进而损害细胞周期进展。

5. 柠檬酸摄取介导ACO2依赖性

接着为明确ACO2是否在体内限制柠檬酸蓄积，构建了他莫昔芬诱导的全身条件性Aco2敲除小鼠模型，给药后小鼠多脏器Aco2表达出现74%~98%的显著下调，伴随血清及部分组织柠檬酸水平升高，其中肾脏升高幅度最为突出，而TCA循环的其他代谢物基本无变化，同时Aco2缺失仅引发小鼠肾脏皮质肾小管上皮细胞出现明显空泡变性，肾损伤标志物NGAL呈强阳性，证实ACO2缺失可诱导肾组织损伤；且随时间推移，小鼠肾脏与循环中的柠檬酸水平呈进行性升高，同时肾脏中p-eIF2α/ATF4介导的ISR显著激活，肾损伤相关靶基因明显上调、近端小管特征性基因呈下调趋势。基于肾脏是机体唯一可从循环中净摄取柠檬酸、且近端小管细胞高表达柠檬酸高亲和力转运体SLC13A2与ACO2的器官，研究提出柠檬酸摄取会驱动机体对ACO2介导的柠檬酸清除产生功能依赖性的假说，并通过饮水补充柠檬酸钠的体内实验验证发现，柠檬酸补充可使ACO2缺陷小鼠的循环柠檬酸水平进一步大幅升高、生存期显著缩短，同时小鼠肾脏的ISR激活与肾损伤相关分子特征进一步加剧，证实柠檬酸水平升高会强化体内对ACO2柠檬酸清除功能的依赖。

后续体外细胞实验进一步验证了核心结论：内源性低表达 SLC13A5、具柠檬酸摄取能力的 HepG2 肝癌细胞，ACO2缺失后补充丙酮酸或柠檬酸，会显著加剧细胞内柠檬酸蓄积，诱导细胞死亡、增殖受损，而敲低SLC25A1阻断线粒体柠檬酸输入可逆转该表型，说明具备柠檬酸浓缩转运能力的细胞在胞外柠檬酸存在时，依赖ACO2完成线粒体柠檬酸的分解代谢；在原本不内源性表达柠檬酸转运体的非小细胞肺癌细胞系中过表达SLC13A2、强制赋予其柠檬酸摄取能力后，仅在胞外补充柠檬酸的条件下，ACO2缺失会显著加剧细胞死亡与增殖障碍，该效应呈柠檬酸剂量依赖性，甚至在接近生理循环浓度的柠檬酸水平下即可显现，同时伴随细胞内柠檬酸进一步蓄积与ISR通路激活，最终证实细胞自主性的柠檬酸摄取足以增加细胞对ACO2的功能依赖性。

03 研究结论

1. 促进柠檬酸生成的营养条件，可激活三羧酸循环（TCA 循环）的正向代谢通量。

2. 柠檬酸水平升高，会使细胞依赖三羧酸循环关键酶ACO2来完成柠檬酸的代谢清除。

3. 柠檬酸的累积会激活整合应激反应，进而损伤细胞适应性。

4. 净摄取柠檬酸的细胞与组织（如肾脏），其生理功能依赖于ACO2。