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Science子刊丨代谢组学研究发现发热伴血小板减少综合征与精氨酸代谢异常有关

发布日期:2020.06.10 浏览次数(975)



代谢组学和医学研究

医学代谢组学,顾名思义是以研究疾病的发病机理、诊断分型以及早期预测为目标的代谢组学技术。代谢物是遗传信息表达的最终产物,基因和蛋白质表达的微小变化通常引起代谢物层次的巨大变化。作为主流代谢组学平台的色谱质谱联用技术具有高灵敏度和高特异性优点。因此代谢组学是目前疾病表型研究最灵敏的组学技术之一。


应用案例
对精氨酸缺乏的代谢组学研究


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01
研究内容简介

2009年,中国首次发现发热伴血小板减少综合征(SFTS),多省市发生过地方聚集性疫情。该病住院患者病死率高达12-30%,近年在高发省份发病率呈现逐渐增长的趋势。该病是一种虫媒病毒性出血热,一般以发热伴呼吸道或消化道急症起病,初始症状与流感等病毒性感染疾病不易区分,随即出现血小板和白细胞进行性下降。其临床特征包括高热、血小板和白细胞减少、出血、胃肠道症状及多脏器功能衰竭。目前尚无疫苗,也缺乏有效的临床干预手段,是传染病研究中的一个难题。世界卫生组织已经将发热伴血小板减少综合征(SFTS)病毒列为最需要关注的病毒之一。本篇文献作者采用代谢组学技术对这一疾病的致病机制进行研究。而在之前的研究中,作者已经确定精氨酸代谢是参与SFTS病毒(SFTSV)与宿主应答相互作用的关键途径。精氨酸是一种非必需氨基酸,其代谢不仅具有重要的创面愈合功能,还与宿主免疫反应相结合,与骨髓衍生抑制细胞(MDSC)相关。MDSC对精氨酸代谢的调节作用已在多种慢性感染如HIV和单纯疱疹病毒感染中得到证实。然而,MDSC相关的精氨酸剥夺或整体代谢变化在急性病毒感染中尚未被很好地描述。因此,为了确定补充精氨酸是否可以逆转病毒引起的发病机制改变并提供临床益处,作者对SFTS患者进行了随机对照试验,并研究了精氨酸在该病临床发展过程中的有效性。


02
研究方法

采用病例对照研究,确定SFTS感染的特异性差异代谢产物。共抽取46名SFTS患者、46名健康对照组和46名非SFTS发热对照组进行代谢组学分析,并验证精氨酸代谢紊乱及其生物学效应。对44例SFTS患者和48例健康对照者进行血小板、免疫表型及氨基酸含量的检测。

最后,选择53例和60例SFTS患者分为精氨酸治疗组和安慰剂组,进行随机、单盲、安慰剂对照试验,以验证精氨酸给药的效果。


03
实验结果

代谢组学分析

为了确定与SFTSV感染相关的代谢紊乱,作者使用基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的代谢组学方法对两组独立患者血清中代谢物进行检测分析,在242份临床样本中共测到了166种代谢物(第一组为46例急性感染和成对恢复期样本,对照组为46例健康对照组和46例非SFTS发热组;另一组为10例死亡对照组和10例存活对照组,对照组为16例健康对照组)。通过使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和主成分分析(PCA)模型(图1、A和B),该靶向代谢组学分析能够区分急性SFTSV感染与健康对照组和非SFTS、发热性疾病,也能区分致命和存活病例,A和B)。在通过单因素方差分析(ANOVA)对代谢物[组间比较的可变重要度(VIP)值>1或P<0.05]进行筛选后,层次聚类显示组间的代谢特征不同(第一组63种不同代谢物,第二组80种不同代谢物,54种不同代谢物两组共同的差异代谢物(图1,C和D)。



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图1


使用Metaboanalyst3.0在线工具(16)对改变的代谢物进行代谢途径分析(MetPA),揭示精氨酸代谢途径的变化最为显著(图1E)。通过提取精氨酸相关代谢物的相对浓度(RCs),作者发现,与健康对照组相比,精氨酸RC在SFTS急性期显著降低(P<0.001)(图1F)。此外,死亡病例的精氨酸浓度甚至低于存活病例(图1G)。精氨酸RC在存活病例的恢复期明显恢复,而在死亡病例的恶化期无明显恢复。苯丙氨酸的趋势则相反,这表明精氨酸RC的减少是由于下游分解代谢的改变,而不是蛋白质降解的严重损害,因为苯丙氨酸可以作为蛋白质降解的反映。精氨酸可以被一氧化氮合成酶(NOSs)催化为一氧化氮(NO)和瓜氨酸,瓜氨酸RC也与临床结果相关(死亡恶化与存活恢复的比值P=0.002)。由此,作者认为精氨酸代谢在对SFTSV感染的反应中被改变,并可能会促进病毒的致病过程并恶化患者的预后。


精氨酸缺乏使血小板内一氧化氮(NO)浓度降低,血小板减少

由于有研究表明精氨酸/一氧化氮代谢途径减弱可能导致血小板功能障碍,作者研究了患者血小板中一氧化氮合酶活性是否影响疾病进展。首先,作者分析了SFTS患者血小板单细胞水平上血小板内一氧化氮(Plt-NO)的生物合成。和预期相符,Plt-NO显著降低(P=0.004)(图2A),与同一时间点测得的血小板计数呈正相关(图2B)。作为NO的前体,在早期1天测得的精氨酸浓度与血小板计数具有相似的相关性(图2C)。研究表明,精氨酸/NO是抑制血小板活化的重要途径之一。作者发现精氨酸浓度与血小板活化呈负相关,由PAC-1(活化整合素αIIb/β3)表达反映(图2D),这在SFTS患者中也升高(P=0.009)(图2E),表明血小板丢失可能与SFTSV感染时血小板活化有关。

进一步的研究发现血小板单核细胞复合物(PMC)和血小板凋亡的频率显著增加(P=0.007和P<0.001)(图2,F和G),这表明血小板过度活化可能有助于减少循环中的血小板计数。此外,精氨酸在体外可适度减轻SFTSV诱导的血小板活化,而NOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐可减弱精氨酸对血小板活化的抑制作用(图2H)。

根据这些结果,作者认为精氨酸对血小板稳态的调节作用类似于慢性心血管疾病,可能通过精氨酸/氧化氮途径实现,低精氨酸血症可能与血小板减少有关。



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图2


髓源性抑制细胞(MDSC)扩增和精氨酸剥夺对T细胞免疫功能的影响

由于与精氨酸剥夺相关的T细胞受MDSC调控,作者检测了CD3-ζ链在T细胞中的表达水平,结果发现T细胞中CD3-ζ链表达减少(图3A,B),且CD3-ζ链对免疫调节的影响与T细胞亚群和病毒载量呈负相关(图3C)。对39例急性SFTSV感染患者和35例健康对照组新鲜外周血中粒细胞性MDSC (gMDSC)和单核细胞性MDSC (mMDSC)的表达频率进行了评估。在所有外周血单个核细胞(PBMC)亚群中,扩增的gMDSC表达了细胞内最高的精氨酸酶浓度,并且在18例SFTS患者中观察到精氨酸酶+ gMDSC与PBMC的比值升高(图3G)。在这些病例中,gMDSC表面CD63表达频率也更高(图3H),表明gMDSC有脱颗粒和释放精氨酸酶I的趋势。此外,gMDSC的扩增与血清精氨酸酶I浓度升高同时发生,gMDSC频率与循环精氨酸浓度呈负相关(图3J),以及循环精氨酸浓度与病毒载量呈负相关(图3K)。

由此,作者认为SFTSV诱导 gMDSC通过精氨酸酶减少精氨酸,造成SFTSV感染T细胞、CD3-ζ链损伤,从而导致T细胞反应障碍。



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图3


氨基酸靶向检测

为了验证精氨酸及其相关代谢物的系统变化,作者对44例SFTS患者的血清氨基酸进行了定量分析。与30名对照组样本相比,急性SFTS患者的精氨酸和瓜氨酸浓度显著降低(P均< 0.001),而鸟氨酸浓度升高(P = 0.043)(图4,A至C)。

同样,在SFTS患者中,鸟氨酸/精氨酸比例升高,而瓜氨酸/精氨酸比例略有下降(图4、D和E)。这些结果证实精氨酸代谢倾向于优先产生尿素/鸟氨酸,而不是一氧化氮(NO)。研究发现,以精氨酸/(鸟氨酸+瓜氨酸)计算的整体精氨酸生物利用度(GABR)在SFTS患者中显著降低(图4F),在SFTS致死患者中甚至更低(图4G)。



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图4


补充精氨酸对临床和实验室指标的影响

为了证实这些结果,作者随后通过随机对照试验探讨了补充精氨酸是否可以改变SFTSV感染疾病进展或结果。筛选出53 名接受精氨酸治疗的患者(精氨酸(20 g /天,静脉注射葡萄糖)加维持疗法)和60名对照患者(只进行维持疗法)。

生存分析显示,与对照组相比,精氨酸治疗组的血小板恢复速度加快至正常值【调整危险比(HR) =1.508;95%置信区间(CI),1.010 ~ 2.254;P =0.045】(图5C)。此外,接受精氨酸治疗患者T细胞CD3-ζ链的表达显著增加(图5,D和E),表明T细胞CD3-ζ链表达的恢复可能与精氨酸补充有关。



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图5


04
结果讨论

SFTS病例中精氨酸缺乏,提示NOS和精氨酸酶对精氨酸的分解代谢是SFTSV感染及死亡的重要途径。精氨酸缺乏与Plt-NO浓度降低有关,可能与血小板活化和血小板减少有关。SFTSV感染后,表达精氨酸酶的MDSC扩张,与T细胞CD3链下调和病毒清除障碍有关,提示精氨酸酶活性和精氨酸耗竭在抗SFTSV T细胞功能损害中的作用。GABR测定可被认为是一种更全面的NO合成能力降低的测定,同时作者认为,SFTS死亡率的有效预测因子应该测定整体精氨酸生物利用度(GABR),而不是精氨酸浓度。在一个独立的SFTS患者组上进行的随机对照试验表明,精氨酸的应用与提高Plt-NO浓度、抑制血小板活化、提高CD3链表达和血小板计数相关,最终达到加速清除病毒的目的。

1.NOS在血小板中的表达和功能

众所周知,NO调节血小板功能并刺激血小板中可溶性鸟苷环化酶,导致鸟苷-3',5'-环单磷酸(cGMP)增加,从而激活cGMP依赖性蛋白激酶。这反过来又通过各种途径抑制血小板活化,例如NO抑制磷脂酰肌醇3激酶的活化,并引起GPIIb-iia纤维蛋白原受体(PAC-1表达)的活化。据报道,低浓度的精氨酸可直接损害血小板的一氧化氮合成,导致血小板的高聚集性。然而,这一途径的重要性主要局限于心血管疾病。本次研究提供了重要的数据表明,SFTS患者血小板精氨酸缺乏和随后的NO下调可能参与血小板活化,这可能与血小板单核细胞聚集和血小板凋亡有关,从而在血小板清除和血小板减少的发生发展中起到作用。

2. 精氨酸代谢紊乱参与了MDSC的扩张

有研究证实MDSC在肿瘤浸润中扩张,并通过产生精氨酸酶I(排出精氨酸)下调局部和全身免疫反应。近年来,研究人员还发现,MDSC通过限制包括T细胞和自然杀伤细胞在内的几种免疫细胞的功能,有效地抑制抗病毒宿主免疫。因此,作者认为gMDSC与SFTS中精氨酸消耗之间存在联系,并对T细胞亚群的有抑制作用。随后的随机对照试验进一步证实了这一结论,在给予精氨酸后,血小板活化和抑制的T细胞CD3链表达均得到纠正,显示其对实验室异常恢复和减轻临床预后的潜在有益作用。然而,为了避免影响血压,随机对照试验设计仅限于治疗轻度病例,因此,精氨酸在降低病死率方面的作用仍需要探索。


05
分享讨论

本次研究中,作者揭示精氨酸在治疗具有类似发热伴血小板减少综合征(SFTS)临床特征的传染病方面的潜力值得探索。而进一步的代谢组学研究也有望为其他新出现的传染病找到新的治疗靶点,体现了代谢组学作为一门新技术,在临床研究和新型治疗靶点发现的研究中也可以起到重要作用。



✎ 文献出处

Li XK, Lu QB, Cao WC. et al. Arginine deficiency is involved in thrombocytopenia and immunosuppression in severe fever with thrombocytopenia syndrome. Science Translational Medicine2018, 10, eaat4162. 

DOI: 10.1126/scitranslmed.aat4162.



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