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Scientific Reports丨慢性不可预知轻度应激对大鼠的代谢组学的系统性影响的研究

发布日期:2020.05.25 浏览次数(560)

代谢组学和医学研究

在医学领域,代谢组学是以研究临床整体、器官、组织及细胞的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或外在因素的影响及随时间变化规律为目的,通过揭示代谢组整体变化轨迹来反映某种病理生理过程中所发生的一系列生物事件。能够在基因解析、病理阐述、药物设计开发、病变标志物筛选、疾病诊断分型和治疗效果预测等医学相关领域发挥显著作用。

应用案例
抑郁症的代谢组学研究


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01
研究内容简介

抑郁症又称抑郁障碍,发病率和死亡率都很高。以显著而持久的心境低落为主要临床特征,是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称,情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝,自卑抑郁,甚至悲观厌世,可有自杀企图或行为;甚至发生木僵;部分病例有明显的焦虑和运动性激越;严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。全球共有约4亿人患有抑郁症,少于25%的患者会寻求有效的治疗;中国约有9000万人患有抑郁症,抑郁症患者接受治疗的大概只有8%,每年有20多万人因抑郁症自杀。

现代医学常使用慢性不可预测轻度应激模型(CUMS)模拟临床抑郁症的方法对抑郁症进行研究。而最近的研究表明,这一方法可能导致机体的非稳态超负荷,从而引发系统性疾病,那么,这种变化在代谢物层面是怎么体现的呢?在本次研究中,作者使用非靶向气相色谱-质谱联用(GC-MS),结合单维统计分析、多维统计分析和通路分析的代谢组学技术,对慢性不可预测轻度应激模型中主要应激靶向组织(血清、心脏、肝脏、大脑和肾脏)中的代谢生物标志物进行研究。

 

02
研究方法
1.动物信息

168周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),180-240 g)随机分为两组(CUMS组和对照组),每组8只。

2.CUMS程序设计

设定实验方案包括:食物不足(24h),水不足(24h),45°笼倾斜(24h),拥挤住房(24h),限制狭小空间(4h),噪音(20min),尾夹(1min),强迫游泳(10min)和昼夜颠倒(12 h / 12 h)。

为了确保程序的不可预测性,随机安排CUMS组大鼠每天接受其中一种,持续4周。采用蔗糖偏好试验(SPT)和强迫游泳试验(FST)评价大鼠抑郁样状态。行为测试的结果使用平均值+标准差(M±SD)描述,并应用GraphPad 8.0版软件进行t检验。

3.样品收集

行为测试后24小时,用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠。采集血液,以5000 rpm离心5 min获得血清。然后迅速切除大脑,解剖大鼠。用0.9%生理盐水清洗整个大脑、心脏、肝脏和肾脏样本,然后将所有样本在-80°C下冷冻并保存。

4.样本预处理和GC-MS检测和数据分析

将收集好待测的各类样本(血清和心、肝、脑、肾等组织)根据GC-MS非靶向代谢组学需要进行预处理和进行GC-MS上机检测。并对于得到的下机数据进行单维统计分析(t-test)、多维统计分析(PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析)差异代谢物定性和通路分析(基于KEGG;http://www.kegg.jp)。

(详细方案见原文,谱领生物可提供包含此项的高质量代谢组学服务)。

 

03
实验结果

1.行为测试

CUMS大鼠在SPT中(57.12% ± 8.22%)的平均蔗糖偏好率明显低于对照组(88.34% ± 4.82%;n = 8, p < 0.0001)。此外,与对照组(106.63 ± 7.76 s;n = 8, p < 0.0001)相比,CUMS导致FST的平均不动时间延长(162.38 ± 9.85 s)。如图1所示,这说明成功建立了抑郁症模型。



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图1


2. 血清和组织样本的GC-MS色谱图

1为通过使用GC-MS进行非靶向代谢组学检测得到的CUMS组和对照组的血清(a)、心脏组织(b)、肝脏组织(c)、脑组织(d)和肾脏组织(e)的代表性GC-MS总离子电流(TIC)色谱图。



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图2

                                

3.代谢组学数据的多元统计分析

利用GC-MS数据进行OPLS-DA分析和排列试验以评估OPLS-DA模型。对照组和CUMS组的血清、心脏、肝脏、大脑和肾脏样本中分别存在1010947种差异代谢物(VIP > 1p <0.05)。



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图3


为了进一步了解CUMS组和对照组之间的代谢差异,对所鉴定的代谢产物的数据进行分析。如图4所示,尽管样本簇稍微重叠,但大多数样本明显地被分为两个不同的簇,这与OPLS分析一致。



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图4

4.代谢通路分析

对差异代谢物进行代谢通路分析(图4(Raw p < 0.5,Impact > 0),作者列出九条重要的代谢通路:

(a)  丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢;

(b)  苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;

(c)  D -谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;

(d)  精氨酸和脯氨酸代谢;

(e)  亚油酸代谢(心脏组织)

(f)   甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(肝脏组织)

(g)  亚油酸代谢(肾脏组织)

(h)  氨酰基-转录RNA生物合成;

(i)   甲烷代谢。

这几条代谢通路主要与氨基酸、脂质、能量、核苷酸代谢相关。

 

04
结果讨论

对照组和CUMS组的血清、心脏、肝、脑和肾组织中分别检测到1010947种差异代谢物。如图5所示,这些代谢物生物标记物涉及9个代谢通路,主要与氨基酸、脂质、能量和核苷酸代谢有关。如图6所示,这些生物标志物彼此密切相关。



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图5


1.  氨基酸及其代谢产物

氨基酸及其代谢产物是许多代谢途径的基本底物和调节因子。氨基酸水平的改变被认为是精神分裂症、老年痴呆症和2型糖尿病的危险标志。在此次研究中,作者发现与对照组相比,CUMS组的L-丙氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-去亮氨酸发生了显著变化。丙氨酸在CUMS大鼠血清和心脏组织中均升高,被认为是抑郁症与心血管疾病的联系之一。L-丙氨酸直接参与糖异生和丙氨酸-葡萄糖苷循环,调节葡萄糖代谢。与γ-氨基丁酸、牛磺酸和甘氨酸一样,L-丙氨酸作为一种抑制性神经递质参与淋巴细胞的繁殖和免疫,但L-丙氨酸与抑郁症的关系仍需进一步研究。谷氨酸,又称谷氨酸,由谷氨酰胺水解而得,是细胞代谢的关键分子。谷氨酸和谷氨酰胺是主要天然抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的前体,在维持细胞氧化还原平衡方面发挥重要作用。但是,在此次研究中,CUMS大鼠的血清谷氨酸水平升高,结果与之前的研究不一致,此外,一项早期的研究也使用GC-MS来评估慢性不可预测轻度应激模型大鼠的四个脑区。总的来说,谷氨酸的紊乱可能是由于谷氨酰胺-谷氨酸循环的紊乱,这可能是抑郁症发病的部分原因。L-苏氨酸和甘氨酸参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。甘氨酸是一种半必需氨基酸和基本营养素。甘氨酸作为内源性抗氧化剂GSH的组成部分,参与了氧应激和与抑郁相关的细胞膜损伤过程。在研究中,心脏和肝脏L-苏氨酸升高和心脏甘氨酸降低与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢异常有关。苯丙氨酸是一种必需的氨基酸和儿茶酚胺的前体,儿茶酚胺是神经递质和肾上腺素样物质,在抑郁症中起着至关重要的作用。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是支链氨基酸(BCAAs),参与应激、能量产生和肌肉代谢。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸水平的异常在首发精神病中有记录。此次研究还证明缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸水平的异常变化与抑郁症有关。

 

2.  脂肪酸

此前有研究表明抑郁障碍患者的脑内多不饱和脂肪酸(PUFA)比率和单不饱和脂肪酸(MUFA/饱和脂肪酸(SFA)含量(如二十二碳六烯酸,C22:6n-3;油酸,C18:1;棕榈酸,C16:0;硬脂酸,C18:0)发生变化,这可能是病理发生和发展的基础。在此次研究中,作者发现在血清和肝组织中亚油酸代谢紊乱。亚油酸是花生四烯酸(a a)的前体,与炎症、2型糖尿病和心血管疾病有关。炎症和氧化应激在抑郁症发病机制中起着重要作用。此外,核红细胞相关因子2Nrf2)参与代谢稳态和炎症反应,已成为抑郁症防治的一个有前途的靶点。早期的研究表明,鱼油和共轭亚油酸可诱导Nrf2的上调,并在大鼠抑郁模型中评价了它们的保护作用。CUMS组大鼠亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸酰胺和棕榈烯酸的水平与对照组大鼠相比发生了显著变化,这一发现可能有助于理解导致抑郁的炎症和氧化应激的分子机制。

 

3. 甲烷代谢

此次研究首次发现CUMS会导致抑郁大鼠肾脏甲烷代谢紊乱。在全球碳循环中,甲烷主要由甲烷氧化菌和产甲烷菌代谢。在厌氧条件下,产甲烷菌可以通过将有限数量的底物转化为甲烷来获得生长所需的能量。在研究中,L-丝氨酸参与甲烷代谢,这突出了L-丝氨酸在细胞增殖和生长中的重要性。因此,肾脏正常甲烷代谢的紊乱可能会对中枢神经系统产生不利影响,导致抑郁。然而,目前还没有足够的证据表明甲烷代谢对抑郁症的影响,还需要进一步的研究。

 

4.  丙酮酸在CUMS组大鼠脑内的代谢

此次研究发现丙酮酸在CUMS大鼠脑内的代谢可能受到干扰,虽然结果并不显著,但由于其高的影响价值,仍然值得注意。丙酮酸是糖酵解的最终产物,是氧化代谢的主要底物,也是葡萄糖、乳酸、脂肪酸和氨基酸合成的研磨点。大脑是一个极其复杂和高度代谢的器官,几乎完全依赖葡萄糖和丙酮酸代谢来产生细胞能量。大脑对ATP有很高的需求,由于其主要依赖碳水化合物代谢来产生ATP,所以受影响最大的是所有组织。丙酮酸代谢异常在癌症、心力衰竭和神经退行性变中起着特别重要的作用。但此次研究由于样本量太小,作者无法检测出丙酮酸代谢的真正显著差异。因此,作者认为了解和开发丙酮酸代谢可能产生新的治疗方法。



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图6


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总结

在此次研究中,作者使用GC-MS平台,结合多维统计分析,来描述主要应激靶向组织(血清、心脏、肝脏、大脑和肾脏)的代谢特征,以全面了解血清和各个组织对慢性不可预测轻度应激诱导的反应。研究结果强调了慢性不可预测轻度应激组(CUMS组)与对照组大鼠相比,体内代谢产物和生化途径的不同,有助于理解慢性不可预测轻度压力诱导的抑郁的病理生理机制。


✎ 文献出处

Geng C, Guo Y, Wang C. et al. Systematic impacts of chronic unpredictable mildstress on metabolomics in rats.Scientific Reports, 2020 .



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