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以靶向定量为基础的代谢组学揭示了乳腺癌患者独特的脂质结构

发布日期:2019.11.22 浏览次数(68)

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研究背景


据美国癌症协会统计,乳腺癌仍是美国女性中最常被诊断和与死亡相关的癌症之一。2012年,美国约226,870名女性被诊断出患有乳腺癌,占所有新诊断的女性癌症患者的29%。据估计,在过去的一年中,乳腺癌在美国导致39,000多人死亡,是妇女第二大导致癌症死亡的原因。早期诊断可以显著提高乳腺癌的长期生存率。目前,乳腺X射线摄影术是检测乳腺癌的最可接受和最有效的筛查程序,并被美国预防服务工作队(USPSTF)推荐给40岁以上的女性。但是,由于该筛查的假阳性率高,USPSTF于2009年将其建议修改为降低乳腺X线筛查的频率。其他成像技术,例如超声检查和磁共振成像,也已用于乳腺癌筛查。不幸的是,即使包括了这些成像技术,仍约20%的乳腺癌患者无法被检测到。血浆(或血清)生物标志物(例如抗原和蛋白质模式)很有前景;但它们仍然离临床使用还很远。一些肿瘤标志物,例如CA15.3和CA27.29,仅建议用于治疗性监测,而不建议进行筛查。因此,迫切需要可以单独使用或与其他现有方法结合使用的新型有效的乳腺癌筛查生物标志物。

除了遗传和蛋白质组学变异之外,与正常细胞相比,癌细胞已显示出不同的代谢变异。基于质谱(MS)和核磁共振(NMR)的先进代谢技术已经在寻找癌细胞和临床样品。为了支持癌细胞的快速增殖,脂肪形成的增加被认为是许多类型癌细胞的代谢特征。各种研究中还报道了血浆(或血清)脂质(例如总胆固醇,高密度脂蛋白和甘油三酸酯)与乳腺癌风险之间的关联。使用MS的先进分析技术可以对给定的生物样本中的数百种脂质进行靶向分析和同时定量。最近报道了基于MS的乳腺癌组织中不同脂质组成与正常组织水平相比的分析结果,揭示了脂质代谢(如PC(磷脂酰胆碱)(14:0/16:0)水平)与脂质代谢之间的高度相关性。肿瘤等级或雌激素受体的状态。作者假设肿瘤组织中脂质表达的变化将导致乳腺癌患者血浆中独特的脂质谱,这可以通过靶向和定量代谢组学方法进行检测。检测到的区分血浆脂质可用作乳腺癌早期筛查的新生物标记。

在本研究中,作者使用定量和靶向代谢组学方法结合电喷雾电离串联质谱(ESI-MS / MS)分析了55名乳腺癌患者和25名健康对照的血浆样品。这项研究的目的是确定潜在的诊断性生物标志物,并增进对乳腺癌脂质代谢的了解。

实验部分


样品信息


从希望之城综合癌症中心收集了总共53例乳腺癌患者和25例健康对照。为了避免乳腺癌(BC)患者和健康对照之间的年龄差异的影响,将样本分为训练组和测试组。在训练组中,乳腺癌组(30名受试者)的平均年龄为41.3(25-56岁),健康对照组(20名受试者)的平均年龄为38.2(28-40岁),两者之间的年龄无显着差异组(p = 0.111)。表2提供了更详细的信息。为了避免食物的影响,早餐前要采集所有血液样本。

样品处理和代谢物分析


作者的目标代谢组学方法基于使用AbsoluteIDQTM p180试剂盒的电喷雾电离质谱(ESI-MS / MS)测量。该试剂盒可同时定量40个酰基肉碱,90个甘油磷脂(14个溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱),15个鞘脂和1个己糖。

实验结果


多元分析


本研究共分析了146种代谢物。对这些代谢物,首先对训练数据集进行主成分分析(PCA)。观察到样品组之间的分离情况,大多数健康对照散布在图的顶部,而大多数乳腺癌样品散布在图的下半部(图1)。PCA模型揭示了乳腺癌患者和健康对照之间的一般代谢信息。为了进一步说明与癌症发病率相关的代谢变化,建立了具有一个预测分量和两个正交分量的监督正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型。如图2A所示,在得分图中获得了清晰的分离,所有乳腺癌患者在左半部分,健康对照者在右半部分。为了进一步验证已建立的模型,对相应模型执行了999次置换测试。结果表明,置换试验中所有R2和Q2值均低于原始值。该ÿQ2的轴截距小于零(Q2截距(0,-0.295))。这些结果验证了当前的PCA模型。

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图1. 主成分分析(PCA)图

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图2. 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图和置换检验

代谢物鉴定


基于OPLS-DA模型中预测(VIP)值的可变重要性,选择了VIP> 1的46 种代谢物。还使用Student t检验进行了单变量分析,以选择不同的代谢物。用经典的一阶段方法进行错误发现率(FDR)测试后,选择了39种代谢物,调整后的p值均小于0.05(表1)。这39种差异化代谢产物包括10个溶血磷脂酰胆碱(lysoPC),23个甘油磷酸胆碱(PC,9个PCAas和14个PC Aes),5个鞘磷脂(SM)和1个酰基肉碱。作者们进一步比较了体重指数(BMI)<25(n)的乳腺癌患者中这39种差异化代谢产物的浓度。在t检验中,体重正常的患者和肥胖的受试者在这39种代谢物中只有5种显着不同。这五个代谢物被排除在作者们的诊断方程之外。FDR调整后,没有代谢物显示出显着差异,q值低于0.05。

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表1. 乳腺癌患者和健康对照之间的代谢物差异

诊断方程


为了建立从健康对照中识别乳腺癌患者的简单诊断方程式,将从训练数据集中选择的39种分化代谢物输入SPSS以进行逻辑回归。结果表明,三种代谢物(lysoPC a C16:0,PC ae C42:5和PC aa C34:2)的浓度显着影响乳腺癌患者和健康对照组之间的诊断结果。利用这三种代谢物的浓度,建立了y = lysoPC a C16:0×1.034 + PC ae C42:5×44.248-PC aa C34:2×0.585-37.002 的诊断方程。计算每个样本的Y值(在训练和验证数据集中)。散点图显示,几乎所有的ÿ从乳腺癌样本获得的-值低于零,而来自健康对照的y值高于零(验证数据集中的一个乳腺癌样本和一个健康对照除外,图3),灵敏度为98.1%,特异性为96.0%,阳性预测值为98.1%,阴性预测值为96.0%。

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图3. 散点图

由于验证数据集中乳腺癌组的年龄差异较大,因此对年轻乳腺癌患者和老年乳腺癌患者中这三种代谢物的浓度进行了分析。结果显示年龄在41岁以下(n= 17)的乳腺癌患者与乳腺癌患者之间的这三种代谢产物(lysoPC a C16:0,PC ae C42:5和PC aa C34:2)无显着差异。年龄超过60岁(n= 12)。此外,对于年龄小于50岁(n= 29)和年龄大于50岁(n= 24)的患者,这三种代谢物均未观察到显着差异。因此,年龄并不是这三种代谢物的混杂因素。

磷脂酰胆碱


甘油磷脂包含脂质代谢物的两个亚类,PC二酰基(PC aa)和PC酰基烷基(PC ae)。总共选择了23种甘油磷脂作为区分代谢物(表2),其中大多数在乳腺癌患者的血浆中较低。在所有磷脂酰胆碱中,检测到PC ae 40:3是脂质中统计学上最显着的下降(p值为2.79×10 -10)。乳腺癌患者血浆样品中甘油磷脂的减少可能反映了磷脂酶A2(PLA2)的较高活性,这是一种酶家族,可将甘油磷脂水解为lysoPC和脂肪酸。

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表2. 受试者的临床信息和特征

以前的研究表明,PLA 2的表达在癌症患者中被上调。PLA 2的活性中观察到如在侵入性乳腺癌肿瘤组织比良性乳腺肿瘤组织和正常乳腺组织显著更高。PLA 2是一个酶家族,在不同组织中表达的异构体不同。

PLA 2可以通过多种机制参与癌症的发展。它可能通过释放lysoPCs介导癌变,通过其代谢成溶血磷脂酸诱导细胞生长。一些脂肪酸,尤其是花生四烯酸也被释放并代谢成几个分子,其中许多可能诱导细胞生长和增殖。在该研究中,乳腺癌患者血浆样品中大多数lysoPCs的浓度均显着降低,表明花生四烯酸代谢可能是乳腺癌发展的主要因素。此外,PLA 2可能会产生炎症介质,从而促进肿瘤形成。

溶血磷脂酰胆碱


LysoPCs来源于磷脂酶对甘油磷脂的部分水解作用。在乳腺癌患者和健康对照之间鉴定出的差异代谢产物中,有10种选定的代谢产物是lysoPC。与健康对照相比,在乳腺癌患者中检测到的差异化溶酶PCs浓度较低。溶血PC一个C16:0和溶血PC一个C18:0被确定为具有最低的顶部的两个微分代谢物p-值(1.21×10 -13为溶血PC一个C16:0和4.21×10 -13对于lysoPC而言,在所有39种差异化代谢产物中均为C18:0)。有趣的是,据报道,从乳腺癌组织样本中提取的磷脂酰胆碱硬脂酸(C18:0)在那些已发生转移的患者中明显较低,甚至被认为是乳腺癌预后的独立肿瘤内标志物。据报道,lysoPC a C16:0和lysoPC a C18:0的降低与肝细胞癌组织中PC的降低有关。

这两个lysoPC(lysoPC a C 16:0和lysoPC a C18:0)是血浆中最丰富的lysoPC。两种lysoPCs水平的降低将在很大程度上降低血浆中总lysoPCs的浓度,以前据报道这与癌症患者的激活的炎症状态有关。实际上,在乳腺癌患者中发现血浆总lysoPCs(当前研究中检测到的所有14种lysoPCs的浓度之和)显着降低(p= 6.87×10 -8,倍数变化(FC)= −1.67,乳腺癌为健康对照)。lysoPC a C 20:4的平均浓度显示出从I期到IV期乳腺癌患者的下降趋势(I期为9.22±3.62μM,II期为8.64±2.20μM,III期为8.37±3.20μM,而7.87±阶段IV为2.50μM)。那些lysoPC包含非常长的链脂肪酸,例如lysoPC a C24:0,lysoPC a C26:0和lysoPC a C28:0,在乳腺癌患者中其含量也显着降低。溶血磷脂酶可被溶血磷脂酶代谢,并进一步代谢为脂肪酸和胆碱。较低的lysoPCs水平可能反映了乳腺癌患者的新陈代谢率较高。据报道,自分泌运动蛋白(一种分泌的溶血磷脂酶D)可增强肿瘤细胞的运动能力,存活率和增殖能力。实际上,据报道,自分泌运动蛋白和溶血磷脂酸的表达有助于小鼠模型中乳腺癌的发生和发展。

肉毒碱


与健康对照相比,乳腺癌患者血浆样品中甘油磷脂的较高水解速率与较高水平的酰基肉碱相关。在这项研究中,酰基肉碱C4被选作差异代谢产物。此外,在乳腺癌患者中检出了更高浓度的其他几种酰基肉碱(例如酰基肉碱C18,C18:2,C3和C5),p值低于0.05(C18 p = 0.034,C18:2 p = 0.037,p18 = 0.037)。 C3和C5均为0.015)。增加的酰基肉碱浓度表示高级脂肪酸β-氧化的乳腺癌患者,这与最近的研究,其指示脂解和脂质氧化在癌细胞[被上调一致]。脂肪酸可以通过β-氧化来消耗,从而为癌细胞的生存提供关键的替代能量。在某些类型的癌症中,例如前列腺癌,脂肪酸氧化被认为是主要的生物能途径。在肾癌患者和癌症高级别患者中也观察到几种酰基肉碱浓度的升高,这表明酰基肉碱浓度可能是癌症状态和肿瘤级别的有前途的标志。

神经鞘磷脂


包括SM(OH)C22:2,SM(OH)C14:1,SM(OH)C16:1,SM(OH)C22:1和SM C20:2在内的所有五个区分鞘磷脂(SM)在乳腺癌患者中的水平。SM是细胞膜的丰富组成部分,并且优先集中在大多数哺乳动物细胞的质膜的外部小叶中。SM通过SM循环在调节细胞生长和分化中起着重要作用。一些信号代谢物,例如神经酰胺,鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇,参与了该循环。许多研究表明,神经酰胺是癌细胞对FAS / FAS配体,肿瘤坏死因子-α(TNFα),生长因子戒断,缺氧,高热和DNA损伤等诱导细胞凋亡的重要信号分子。实际上,与邻近的正常组织相比,在乳腺癌组织中检测到更高水平的神经酰胺合酶和神经酰胺。S1P是另一种衍生自SM的生物活性脂质,据报道可通过细胞内和受体介导的机制调节癌细胞的生长,存活和迁移。SM循环水平增加的结果可能表明乳腺癌患者SM循环功能异常,这可能调节癌细胞的生长和转移。

在乳腺癌的早期阶段,检测到某些SM的浓度较高,例如SM(OH)C22:1,SM(OH)C22:2,SM(OH)C24:1和SM C26:0。显示出从I期到IV期乳腺癌患者的持续减少(图4)。SM(OH)C22:1,SM(OH)C24:1和SM C26:0仅在患有早期癌症的乳腺癌患者中显着升高,但不是在乳腺癌患者在晚期阶段(阶段III和IV期)。这些结果表明,某些SMs标记物在早期患者中受到的影响更大。与早期患者相比,晚期患者中这些SMs降低的潜在机制尚待阐明。

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图4. 四种特征性鞘磷脂的条形图

结论


在该项研究中,作者使用靶向和定量代谢组学方法分析了53名乳腺癌患者和25名健康对照的血浆样品中的一组脂质。OPLS-DA模型使用由30位患者和20位健康对照组成的训练数据集显示出乳腺癌患者与健康对照之间脂质谱的明显区别,并成功预测了与验证数据集中的控件。在乳腺癌患者中,所选择的差异代谢物(包括39种脂质)显示出较低的溶血磷脂酰胆碱水平和较高的鞘磷脂和酰基肉碱水平。建立了使用三种代谢物(lysoPC a C16:0,PC ae C42:5和PC aa C34:2)的诊断方程,该方程成功地将乳腺癌患者与健康对照组分离,灵敏度为98.1%,特异性为96.0%。当前研究的局限性在于样本量相对较小,尤其是对于验证数据集中的健康对照。




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