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研究背景

越来越多的证据表明，抗生素(Abx)在停用后对肠道微生物群的延迟作用不如其对宿主代谢的直接作用有利。然而，目前还不清楚不同的Abx依赖代谢效应如何影响糖尿病患者，以及肠道微生物群是如何参与其中的。在这里，该研究用Abx鸡尾酒治疗db/db小鼠12天，停药24天。我们发现db/db小鼠在Abx治疗后体重和血糖下降，在Abx停止后迅速恢复。Abx停药24天后，db/db小鼠的血浆、肝脏总胆固醇(TC)水平和肝脏重量均升高。

分子生物学研究表明，肝内胆固醇BA合成受到抑制，细胞内胆固醇转运受阻，胆汁排泄受阻，均与肝脏TC积累有关。肠道微生物群组成的改变、微生物代谢物谱和宿主表型之间的关系表明，存在肠道微生物群相关的机制，介导Abx对db/db小鼠胆固醇代谢的不利延迟效应。因此，我们呼吁在糖尿病动物模型中应用Abx来研究微生物与宿主的相互作用，以及在2型糖尿病患者中应用Abx来预防慢性心血管后果时要谨慎。谱领生物提供此文核心胆汁酸与短链脂肪酸绝对定量检测服务。

模型构建

这篇研究篇幅较长 ，让小编先为大家简单的介绍一下实验设计， 针对此项目研究团队构造4种实验模型， 小鼠购买后随机分为对照组(Veh)和抗生素组(Abx)

p-Veh组:再用饮用水喂养24D ；p-Abx组：抗生素治疗12D，再过24D安乐死；Veh组:用饮用水作为喂养12D；

Abx组:含氨苄青霉素(1 g / L),新霉素(1 g / L),链霉素(1 g / L)和强力霉素(1 g / L)的饮用水抗生素治疗12D；

实验方法

葡萄糖和胰岛素耐受性试验

小鼠在禁食一晚后接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。口服葡萄糖溶液，剂量为2 mg/g(体重/体重)。分别于葡萄糖灌胃后0、15和30分钟，取眼眶静脉丛的血。血浆在4℃时立即离心分离，80℃时保存，待进一步分析。

胰岛素耐受性试验(ITT)小鼠禁食6小时后腹腔注射人胰岛素2 IU/kg体重。分别于注射后0、15、30、60分钟用尾出血法测定血糖。

身体成分(脂肪质量和瘦肉质量)

由动物全身成分分析仪(EchoMRI 100H, Houston, TX, USA)根据制造商说明书进行评估。安乐死前，所有小鼠禁食一晚，用10%水合氯醛麻醉。在含有EDTA-Na +和DPPIV抑制剂的试管中收集血液。肝、肠、膜外白色脂肪组织解剖称重，液氮冷冻，80℃保存，进一步分析。

实时荧光定量PCR检测

采用TRIzol试剂(Invitrogen)按照制造商要求提取组织总RNA，用NanoDrop 2000分光光度计定量，1ug RNA用逆转录系统试剂盒(Promega)对cDNA进行逆转录。使用SYBR Green II Master (Takara)对LightCycler 480 (Roche Applied Science)进行实时PCR扩增和检测。

蛋白免疫印迹实验

采用RIPA缓冲液(Cell Signaling Technology)在组织处理器中提取组织蛋白，使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Scientific)根据制造商说明进行定量。

胆固醇和甘油三酯的测量

血浆甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的采用比色法试剂盒(Biovision) 根据制造商说明测定。肝脏脂质测定采用Folch溶液(氯仿/甲醇，2:1，v/v)均质化肝脏组织，组织裂解液和血浆样品按照制造商说明书使用TC和TGs比色试剂盒(Biovision)进行比色酶分析。

肠道菌群代谢物检测

从血浆、粪便和肝脏中提取BAs，采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行分析。从盲肠样品中提取SCFAs，使用气相质谱Agilent 7890A/ 5975C进行GC-MS代谢组学分析。

肠道微生物群16S rRNA基因测序

如前所述，从冷冻粪便中提取DNA 。设定PCR扩增细菌16S核糖体RNA基因的v3-v4区。使用引物41F 5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和另一种引物 806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’组合，熔融温度为56℃，PCR周期为30，其中条形码为每个样品特有的8碱基序列, 将分类等级划分为操作单元分类法(OTU)代表性序列。删除未分配的OTUs和未分配给目标物种的OTUs。过滤后的OTU用于下游处理。最后，根据OTU和分类等级对不同种属的筛选进行了分析。

结论

抗生素对db/db小鼠代谢表型的短暂而持久的影响

6周大的雄性db/db小鼠接受了12天的Abx混合物治疗，并在24天内结束。Abx治疗后12天，与Veh治疗组相比，BW呈下降趋势，随机血糖(BG)明显降低。经过12天的Abx处理后，Veh组的BW增益和BG增量明显大于Abx组。所有这些差异在Abx停药后24天就消失了，而Abx停药后，Abx预处理组(p-Abx)的总BW增加量明显高于对照组(p-Veh)。

具体变化见如图1肥胖和糖尿病相关的变化所示：

图1 肥胖和糖尿病相关的变化

抗生素对db/db小鼠肠道菌群组成短暂而持久的影响

通过16S rRNA基因扩增子测序，分析粪便微生物群组成的变化。主成分分析(PCA)在OTU水平上清楚地分离了Abx处理和Abx停药处理的小鼠，Abx治疗后能大大改变了微生物群组成和微生物的直接响应，但还是直方图的类属水平表明，Abx显著治疗组。Abx处理后，Firmicutes和Proteobacteria的相对丰度(RAs)均显著增加，Bacteroidetes和Deferribacteraceae 的相对丰度(RAs)下降。停药24天后，上述菌群分类学变化大部分逆转，但p-Abx组拟杆菌门和厚壁菌门不能恢复到对照水平。

图2 抗生素治疗对肠道微生物群组成的短暂而持久的影响

 抗生素对肠道菌群主要代谢产物的暂时性和长期性影响

接下来分析了Abx对微生物代谢产物、BAs和SCFAs的长期影响。我们首先测定并量化了Abx提取前后不同处理组中Bas含量。虽然血浆和粪便中BA总量的变化不显著，但Abx停药后和p-Abx组BA组分的清晰分离，且比较了p-Abx和p-Veh小鼠盲肠样品中的SCFAs水平。SCFAs检测结果表明，p-Abx与p-Veh相比，总含量无明显变化，乙酸和丁酸盐水平也无明显变化。然而，p-Abx组丙酸和缬氨酸水平显著降低。

图3 抗生素治疗对粪便和血浆胆汁酸(BAs)组成的短暂而持久的影响

总结

综上所述，此文研究首次报道了Abx治疗的延迟或长期效果可以增加db/db小鼠的胆固醇水平。我们发现，肠道BAs、奇数SCFAs和肠道菌群组成的改变，提示了细菌-宿主相互作用的途径，Abx的延迟介导效应，阻碍T2D中宿主肝脏胆固醇的排放。

参考文献：The delayed effects of antibiotics in type 2diabetes, friend or foe? Journal of Endocrinology |doi.org/10.1530/JOE-17-0709|