01 文章导读

肺癌主要发生于老年人，高龄患者预后更差，且转移导致约90%的癌症死亡，但揭示其机制的基础研究却几乎全部依赖年轻小鼠模型。肺癌患者中位年龄为70岁，发病高峰集中在65–75岁，衰老本身与癌症共享蛋白质稳态失衡、表观遗传重塑和营养感知改变等核心特征，使年龄成为癌症发生和死亡最强的风险因素。然而，当前广泛使用的基因工程小鼠模型几乎都选用2–3月龄的年轻动物，这种“年龄脱节”很可能导致在年轻模型中有效的干预策略（如靶向谷氨酰胺代谢的药物）在临床试验中失败。尽管流行病学证据清楚表明衰老与更差的癌症结局相关，但以往研究主要关注衰老的肿瘤微环境，关于生理性衰老如何从内在层面重编程癌细胞本身，从而改变肿瘤进化轨迹与转移能力，仍是一个巨大的知识空白。来自哥德堡大学Volkan I. Sayin、Clotilde Wiel团队在Nature上发表了题为“Ageing promotes metastasis via activation of the integrated stress response”的研究文章，系统阐明了生理性衰老对肺癌进展及转移的影响和机制。

02 研究内容及结果

1. 衰老影响肺癌的进展

该研究在年轻（2–3月龄）和老年（18–19月龄）KP小鼠上，通过气管内注射Cre病毒同时诱导肺肿瘤，发现老年小鼠的原发性肺肿瘤负荷较年轻小鼠降低2.5倍，肿瘤更少、更小且增殖更弱；然而，老年小鼠的肿瘤更早沿去分化路径进展为腺癌，并出现早期转移和生存期缩短。实验结果显示老年小鼠局部淋巴结和远处器官转移率显著升高。体外培养的两种肿瘤细胞增殖能力相当，均保持AT2细胞特征，但老年来源的KP-O细胞上皮-间质转化标志物上调，抗失巢凋亡能力增强，在三维基质中形成更大球体和更多侵袭性结构。尾静脉注射、皮下移植和原位肺移植实验均证实，KP-O细胞在体内具有更强的远处转移和器官定植能力，原位移植后80%受体小鼠出现肝、肾、脑等多器官转移，而年轻组无此现象，且受体生存时间显著缩短。综上，衰老虽限制原发肺肿瘤生长，却促进了肺腺癌的恶性进展与转移扩散。

2. 衰老驱动EMT与UPR通路的激活

为阐明衰老增强肺癌转移倾向的机制，研究者对年轻和老年小鼠来源的KP-Y与KP-O原代肿瘤细胞进行了RNA测序（RNA-seq）和基于转座酶的可及性染色质测序（ATAC-seq），发现衰老细胞的转录组和染色质可及性发生了广泛重编程。通路富集分析揭示，KP-O细胞中上皮间质转化（EMT）和未折叠蛋白反应（UPR）两条通路被显著共同上调。STRING分析显示，KP-O细胞差异基因显著富集于ATF4相关互作网络，而IRE1α和ATF6分支缺乏功能性互作网络，提示UPR通路中主要是PERK–eIF2α–ATF4轴被选择性激活（UPR通过IRE1α–XBP1、ATF6和PERK–eIF2α–ATF4三条分支传递信号）。UPR经PERK介导的eIF2α磷酸化汇入整合应激反应（ISR），最终诱导核心转录效应因子ATF4。

为探究衰老对这些通路的调控，研究者将KP-Y与KP-O细胞置于低糖条件下培养6–24小时，以模拟肿瘤细胞在转移过程中面临的生理性营养应激。结果显示，KP-O细胞中UPR-ISR的PERK分支激活显著增强，PERK磷酸化、eIF2α磷酸化及ATF4蛋白水平均高于KP-Y细胞。值得注意的是，在KP-O细胞中，葡萄糖剥夺后p-eIF2α持续升高并与ATF4诱导同步；然而，当p-eIF2α因GADD34负反馈调控而下降后，ATF4蛋白仍维持高表达。ATAC-seq分析进一步揭示，KP-O细胞中Atf4位点染色质可及性增加，而Gadd34、Hspa5等多个应激消退相关基因位点可及性降低，导致应激信号难以消退，从而维持了ATF4的持久表达。进一步的机制解析表明，衰老细胞中ATF4的持续高表达主要源于其基因位点染色质可及性增加所驱动的转录增强，而非mRNA稳定性或蛋白周转的改变。综上，许可性染色质状态驱动的转录增强与放大的ISR信号协同作用，共同导致了KP-O细胞中ATF4水平的持续升高。

3. ATF4驱动衰老诱导的肿瘤转移

为验证ATF4在衰老诱导转移中的因果作用，研究者首先观察到老年KP小鼠肿瘤中ATF4阳性细胞核比例显著高于年轻小鼠。利用ISR抑制剂ISRIB阻断ATF4翻译，或通过CRISPR-Cas9敲除及shRNA敲低Atf4，均能降低KP-O细胞的抗失巢凋亡能力、克隆形成能力及体内转移负荷，而对KP-Y细胞无显著影响，表明ATF4是衰老细胞维持高转移能力所必需的。反之，在KP-Y细胞中过表达ATF4足以上调EMT标志物、增强抗失巢凋亡能力，并使其转录组向衰老样状态偏移（富集UPR和EMT通路），同时将肺转移负荷提升至与KP-O相当的水平；在人A549肺腺癌细胞中过表达ATF4也显著增加了肺转移负荷及心脏等肺外器官的定植。综上，ATF4既是衰老诱导转移所必需的，也是驱动这一转移状态形成的充分条件。

4. ATF4驱动衰老中的代谢重编程

为探究ATF4是否重编程衰老肿瘤细胞的代谢，研究者利用[1,2-¹³C]-D-葡萄糖进行稳定同位素示踪（区分糖酵解和PPP），发现KP-O细胞的糖酵解通量显著增强，表现为经糖酵解生成的丙酮酸和乳酸同位素标记升高，但磷酸戊糖途径的代谢流未发生改变。与此同时，葡萄糖来源的回补反应（anaplerosis）进入三羧酸循环的通量在KP-O细胞中降低，且[3-¹³C]-葡萄糖示踪进一步揭示丙酮酸羧化酶介导的碳掺入显著减少，提示衰老细胞中的葡萄糖碳流从维持TCA循环中间体的回补途径转向了糖酵解终产物。研究者据此推测，KP-O细胞可能依赖替代代谢途径维持TCA循环。通过[U-¹³C]-L-谷氨酰胺示踪，证实KP-O细胞中谷氨酰胺来源的回补反应显著增强，谷氨酰胺对TCA循环中间体的贡献明显高于KP-Y细胞（需要谷氨酰胺回补：正因为来自葡萄糖的碳（丙酮酸）较少进入TCA循环，导致循环中间物被不断抽走用于生物合成，所以细胞必须依赖谷氨酰胺作为替代碳源来回补TCA循环，维持其基本功能。）相应地，KP-O细胞的细胞外酸化速率ECAR显著升高，而氧消耗速率OCR无变化，（ECAR，主要反应糖酵解速率，糖酵解的终产物释放到培养基中，培养基酸化。OCR反应线粒体的有氧呼吸（氧化磷酸化）活性，瓦伯格效应典型特征，在氧气充足的情况下，细胞也偏好使用糖酵解来将葡萄糖转化为乳酸，而不是高效但较慢的氧化磷酸化）。符合有氧糖酵解与谷氨酰胺回补反应协同增强的代谢特征。机制上，敲除Atf4显著降低了KP-O细胞中谷氨酰胺对TCA循环的贡献，而在KP-Y细胞中过表达ATF4则足以增强谷氨酰胺回补反应，表明增强的谷氨酰胺分解是KP-O细胞中一个ATF4依赖性的代谢特征。综上，ATF4通过重编程衰老肿瘤细胞的代谢网络——增强糖酵解并切换回补燃料从葡萄糖至谷氨酰胺——从而支持其高转移表型。

Tip1:  [1,2-¹³C]-葡萄糖

[1,2-¹³C]-葡萄糖，区分糖酵解和PPP

糖酵解：C1和C2完整保留 → 生成的丙酮酸/乳酸 → M+2

PPP（氧化阶段）：第一步就丢掉C1（变成 CO₂）→ 剩下 C2 进入下游→丙酮酸/乳酸 → M+1

Tip2: 回补反应（Anaplerosis）

指除了草酰乙酸（OAA）与乙酰 CoA 缩合生成柠檬酸的主反应外，所有为 TCA 循环补充催化性中间产物的代谢通路，其核心意义是维持 TCA 循环的运转与兼性代谢功能。

哺乳动物细胞最核心的回补底物分为3大类：

① 丙酮酸：经丙酮酸羧化酶催化直接生成草酰乙酸，是肝脏、肾脏的核心回补通路；② 谷氨酰胺/谷氨酸：经代谢生成α- 酮戊二酸直接进入 TCA 循环，是增殖细胞、肿瘤细胞、免疫细胞最主要的回补底物；③ 丙酰CoA前体：包括奇数链脂肪酸、特定支链氨基酸、C5酮体，经代谢生成琥珀酰CoA补充循环中间产物。

Tip3: 瓦伯格效应

瓦伯格效应由德国科学家 Otto Warburg 于1920年代首次发现，他观察到恶性肿瘤细胞在氧气充足时仍大量将葡萄糖转化为乳酸，而正常细胞则主要通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）高效生成ATP 。这一现象也被称为有氧糖酵解（Aerobic Glycolysis），是肿瘤代谢重编程的核心特征。

5. 靶向代谢可塑性：利用谷氨酰胺依赖性阻断衰老驱动的转移

为评估ATF4驱动的代谢可塑性是否具有治疗窗口，研究者首先通过药物筛选发现，KP-O细胞对谷氨酰胺剥夺及谷氨酰胺类似物DON表现出更高敏感性，而对糖酵解抑制剂2-DG无显著差异。与此一致，KP-O细胞对两种谷氨酰胺酶抑制剂（GLSi）CB-839和BPTES均高度敏感，且对谷氨酰胺转运体ASCT2拮抗剂V-9302也更为敏感。挽救实验揭示，α-酮戊二酸类似物DMG和丙酮酸能够完全逆转CB-839在KP-O细胞中的毒性，而其他代谢物无此效果，表明KP-O细胞的GLSi敏感性源于其对谷氨酸水平下降的脆弱性。这一敏感性依赖于ATF4——ISRIB预处理或Atf4基因缺失使KP-O细胞丧失CB-839敏感性，而在KP-Y细胞中过表达ATF4则使其获得对CB-839的敏感。在3D培养中，GLSi处理消除了KP-O球体的抗失巢凋亡能力，该效应同样可被DMG和丙酮酸挽救，且具有ATF4依赖性。体内实验中，尾静脉注射KP-O细胞的小鼠经CB-839治疗后，肺转移几乎完全消失；而在皮下移植模型中，CB-839虽未影响原发瘤的生长速率或终末重量，却几乎完全消除了KP-O肿瘤的远处转移。综上，衰老诱导且ATF4介导的代谢重编程——即从葡萄糖回补转向谷氨酰胺依赖——构成了转移性肺癌中一个可靶向的代谢脆弱性，为老年NSCLC患者的辅助治疗提供了潜在策略。

6. 衰老与NSCLC转移进展的临床关联

为验证小鼠模型发现的临床相关性，研究者分析了瑞典西部2016–2018年间997例NSCLC患者的诊疗记录。队列中位诊断年龄为71岁，36.9%携带KRAS突变。以小鼠尸检时对应的年龄为参照，将65–75岁与60岁以下患者进行比较发现，65–75岁组KRAS突变比例显著更高，且该年龄段KRAS突变患者出现局部晚期和转移性疾病（IIIb–IV期）的概率显著增加，而KRAS野生型患者未见此趋势。影像学数据分析进一步揭示，在KRAS突变的IIIb–IV期患者中，原发肿瘤大小随诊断年龄增加而显著缩小，与老年KP小鼠原发瘤小而转移倾向高的表型完全一致。公共数据库也印证，人肺癌细胞系的倍增时间与年龄呈正相关，同时EMT标志物随年龄上调。在TCGA肺腺癌队列中，ATF4高表达与早期患者生存无显著关联，但在晚期患者中，高ATF4组中位生存期仅1.28年，显著短于低表达组的2.61年。对瑞典KRAS突变肺腺癌切除组织的分析表明，ATF4核阳性率与诊断年龄呈显著正相关，65岁以上患者ATF4水平显著高于60岁以下者；高ATF4组5年生存率仅32.6%，8年生存率仅13.9%，远低于低表达组的65.7%和60.0%。综上，衰老相关转移增加伴随原发瘤缩小的现象在KRAS突变NSCLC患者中真实存在，ATF4不仅是老年患者预后不良的稳健标志物，更是可靶向的治疗脆弱性，为占NSCLC绝大多数的老年人群提供了新的干预方向。

03 研究结论

1. 衰老是肿瘤进化的主动驱动力： 生理性衰老并非被动背景，而是通过表观遗传重编程，主动改变了KRAS驱动型肺癌的进化轨迹。

2. 解耦生长与转移： 衰老抑制原发肿瘤的局部扩张，但同时赋予肿瘤细胞更强的转移能力，解决了“小原发瘤却预后差”的临床悖论。

3. 核心机制枢纽： 衰老通过使染色质对ATF4更开放，持续激活整合应激反应（ISR）效应物ATF4。ATF4是驱动衰老相关转移的必要且充分的分子开关。

4. 代谢重编程与靶点： ATF4上调导致肿瘤代谢转变为谷氨酰胺依赖型。这创造了一个独特的治疗机会：谷氨酰胺酶抑制剂（GLSi）可以特异性、有效地靶向并消除老年肿瘤细胞的转移能力，而不影响原发瘤生长。

5. 强烈的临床相关性： ATF4在老年肺癌患者中高表达，并与晚期疾病和极差的生存率相关，确立了其作为预后生物标志物和治疗靶点的双重价值。