Nature Protocols丨高分辨率的13C代谢流分析
在代谢工程、微生物学、生物技术和细胞培养的研究领域中，对于生物系统中代谢途径流量的精确化计算是非常重要的。13C代谢流分析（13C-MFA）是测定细胞内代谢物流量的主要技术。本文提出了一个关于13C-MFA的方案，包含平行标记实验、同位素标记测量、统计分析和最佳实验设计。该方案是基于用13C标记的葡萄糖示踪剂来培养在两个（或更多）平行培养基中生长的微生物，然后用气相色谱-质谱（GC-MS）来检测氨基酸、糖原结合葡萄糖和RNA结合核糖的同位素标记情况。然后利用Metran等13C-MFA软件对代谢流量进行估算，进而进行综合统计分析，确定拟合度并计算流量的置信区间。该方案用时时间短、准确性高，与以往的方法相比有了很大的改进。本次研究是以大肠杆菌ΔtpiA为研究对象，进行了完整的代谢模型建立、流量测定及统计分析，为逐步解决复杂的代谢流量计算提供了参考，并且验证该方法在原核和真核生物中均可应用。
在基础和应用生物科学研究中，检测和量化生物化学途径中相关代谢物的代谢流量是具有重要意义的。因为代谢流量代表了细胞代谢的综合能力和功能状态，可以为从微生物到哺乳动物的生物学发展提供关键的可视性证据，并为代谢工程和疾病治疗工作提供相关信息。目前使用较多的是稳定同位素标记的方法，并且13C-MFA已经成为最主流的方法。这个方案参考20多年的方法开发，并结合了一些最近的重要发现和创新，改进了以前方法的局限性，包括严格的实验设计，平行标记实验的综合分析，综合统计分析，以及新的同位素标记测定，为高分辨率流量测定增加了巨大的研究价值。
目前用于定量或预测生物系统中代谢流量的替代方法有很多，包括经典的无示踪实验的MFA方法、流量平衡分析（FBA）和COBRA方法。这些方法通常需要较少的实验信息，即不需要13C标记数据。但是，为了测定代谢流量，必须应用各种建模假设（比如最大生长速率和能量生成模型），并且需要各种代谢模型简化（比如去除无用的代谢循环）。
2020年10月，来自美国特拉华大学化学与生物分子工程系代谢工程与系统生物学实验室的Christopher P. Long教授及其团队在Nature Protocols在线发表了High-resolution 13C metabolic flux analysis的文章，在这项研究中作者提出了一个全面的方案，描述了代谢流量研究中的所有相关的步骤，以确保准确的量化代谢流量。而且这个方案在原核和真核生物中都能得到很好的应用。
图1 高分辨率13C
上图总结了高分辨率13C-MFA的工作流程，第一步就是设计最佳的示踪实验，以确保流量的足够分辨率。更为重要的是，标记实验的物质含量和估算流量的精度在很大层面上取决于示踪剂的选择，如果选择不合适，会直接限制精确解析代谢流量的能力。比如对于一个典型的原核生物的代谢网络，在平行实验中使用[1,2-13C]葡萄糖和[1,6-13C]葡萄糖示踪剂的组合，然后对组合数据进行综合分析则可以获得最全面代谢流量数据。
标记实验：13C-MFA实验实施依赖于设计标记实验时应考虑的一些固有建模假设。比如示踪剂实验应以代谢保持在代谢稳定状态（即，代谢流量恒定）方式进行。当达到同位素稳定状态时，应当收集样本检测标记的同位素（即，代谢物标记完全稳定）。对于连续的培养物，通过分批培养至少5次来确保代谢稳定状态。在分批培养中，取样最好是在早期的指数生长阶段进行，因为当葡萄糖接近耗尽时，通常会观察到复杂的代谢变化，例如醋酸盐积累到较高水平（如下图2所示）。
图2 批量培养以评估葡萄糖的变化
同位素标记和外部速率测量：示踪剂实验期间收集的样品，外部速率（即底物摄取速率、产物分泌速率和生长速率）均被量化。在本研究方案中，通过GC-MS测定标记葡萄糖（步骤 12-16）、蛋白质结合氨基酸（步骤 7-11）、糖原结合葡萄糖和 RNA 结合核糖中的同位素标记。其它的代谢物标记信息可从脂肪酸和细胞内代谢物的分析中获得。外部速率需要至少一个绝对外部速率（例如底物摄取速率）来确定绝对代谢流量（如下图3所示）。
图3 同位素气相色谱-质谱 (GC-MS) 分析的实验程序
代谢模型：标记测量所适用的代谢网络模型应当包括所有相关反应及其各自的碳原子变化规律。该网络可以建立在诸如KEGG\Gor BioCyc等数据库的信息基础上。比如氨基酸代谢模型必须包括底物摄取、中心碳代谢和氨基酸生物合成途径。可以通过直接测量生物量组成，而不是用假定的值。这对于非模式生物尤其重要，因为这些微生物的大分子生物量组成可能与模式微生物存在显著差异。还有就是13C-MFA模型还必须考虑空气中CO2的掺入，空气中CO2可以通过羧化反应稀释同位素标记。导致最终标记效率的降低。
流量估算：代谢模型、外部流量和代谢物标记测量是流量计算所需的三个基本条件。有几种软件平台可用于13C-MFA，包括Metran、INCA等。这些工具都使用基本代谢物单元框架进行同位素标记计算，具有充分的严谨性和较高的计算效率。利用这些程序可以通过观测和模拟测量之间的差异来量化流量。为了确保达到最佳的全方面的拟合，可以进行迭代拟合，其中流量估算从随机初始值重新开始多次计算，直到出现一个单一的收敛解。
统计分析：在估算流量后，进行统计分析，以验证拟合优度并确定流量的置信区间。如果模型足够且测量值无粗差，则方差加权SSR为χ分布的随机变量，自由度等于拟合测量值n减去拟合参数p的个数。如果SSR介于χn pÞ和172 2α=2还需进行额外的统计测试。最后，使用专门的非线性统计分析方法或通过蒙特卡罗模拟计算所有单个流量的置信区间。
图4 大肠杆菌ΔtpiA案例研究的13C-MFA工作流程演示
另外通过这种示踪剂的选择之所以可以提高流量分辨率，是因为在没有tpiA活性的情况下，只有葡萄糖的1,2号位的C可以转化到甘油-3-磷酸中去，因此[4,5,6-13C]葡萄糖示踪剂不会标记甘油-3-磷酸。再进行别的示踪剂实验、测量甘油-3-磷酸标记以及将所有三个平行标记实验与模型拟合之后，获得了统计上可接受的拟合（SSR=183），对估算流量的检验也表明，网络模型中的所有流量目前都可以高精度确定。
目前，13C-MFA已经被广泛视为精确测定流量的金标准，为验证潜在的代谢模型和发现新的代谢反应或者途径提供了依据。
针对上述案例可以看出，大肠杆菌ΔtpiA的流量图与野生型大肠杆菌的流量图明显不同；例如可以观察到三羧酸（TCA）循环流量增加，氧化磷酸戊糖途径流量减少，以及潜在途径的激活，如乙醛酸分流和从草酰乙酸到磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的回流。这些量化了在大肠杆菌ΔtpiA中发生的全局代谢流量重组，以补偿关键糖酵解酶磷酸三糖异构酶的损失。
Christopher P. Long,et al. High-resolution 13C metabolic flux analysis.Nature Protocols. (2019)2856–2877.
