代谢组学常见问题(二):仪器理论篇
01
代谢组学主要检测平台有哪些,如何选择?
主流的代谢组学检测平台有以下三类:
GC-MS(Gas Chromatography and Mass Spectrometry,气相色谱质谱联用)、LC-MS(Liquid Chromatography Coupled Mass Spectroscopy,液相色谱质谱联用)和NMR(Nuclear Magnetic Resonance,核磁共振)(下文均使用英文缩写)。
所有的样品类型都可以用这三类平台检测,但近些年,由于GC-MS和LC-MS的灵敏度高、特异性强和检测的范围广的特点,越来越多使用这两类平台。
02
不同的代谢组学平台各自优缺点是什么?
概括如下图:
03
为什么使用GC-MS检测样品,却很少检测到挥发性的物质?
GC-MS只是一种仪器平台,针对该平台,还需要根据不同的检测要求选择相应的样本制备方法和检测方法。常规的GC-MS代谢组学方法主要采用硅烷化试剂对含活性基团如氨基、羧基、羟基、巯基和磷酸基团等的代谢物进行衍生,提高挥发性和热稳定性,从而实验对这些生理上重要的代谢物进行同时检测。而本身就具有挥发性的代谢物因沸点太低以及极性太强而导致不能被检测到。
如果关注挥发性的物质,请选择谱领生物的挥发性物质GC-MS非靶向代谢组检测产品。
04
为什么有的物质正离子模式下存在,负离子模式下不存在?
质谱端检测器的本质是电场或磁场,待测物质需要离子化(带电)才能进入质谱而从被有效检测。常见的活性基团如氨基易于获得质子如氢从而带正电荷,在正离子模式下检测;羧基、羟基和磷酸基团则易于失去质子从而带负电荷,常在负离子模式下检测;而既含氨基又含羧基、羟基或和磷酸基团的代谢物则既可在正离子模式下检测也可以在负离子模式下检测。因此,非靶向代谢组学检测通常需要既检测正离子模式又需要检测负离子模式,即通常需要检测两次。其次,这也和分析物的性质是有关系的,有的物质容易带正电荷,有的物质容易带负电荷。比如说碱性化合物易带正电荷,加合质子或其他正电荷离子;酸性化合物易带负电荷,失去质子或加合其他负电荷离子。
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色谱质谱串联的优势是什么?
相较于传统检测器,使用灵敏度更高、分辨率更高、定性能力更强的质谱仪代替了光学检测器。将色谱的分离能力和质谱的分辨、定性能力强强联合,可以同时对更多、含量更低的物质进行准确检测,复杂组分中多物质检测的单位时间也大大缩短。
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GC-MS能检测到有机酸、氨基酸、单糖、糖醇、胺类、脂肪酸、吲哚、单甘油酯、核苷、二糖、生育酚、甾醇等代谢物。
07
GC的流动相(载气)为气体(通常为高纯氦或者氢),这就要求被分析物必须能够气化,而生物样本中很多内源性代谢物都含有极性基团,具有沸点高、不易气化特点或者高温下容易降解。衍生化能够降低这些代谢物的沸点,增加它们的热稳定性,以便分析能够顺利进行。
衍生化方法及试剂种类繁多,根据不同的分析目标,需选择合适的衍生化方法。如分析脂肪酸,可采用甲酯化衍生。在GC-MS代谢平台上,最常用的衍生化方法是硅烷化衍生,因为它的广谱高效。在进行硅烷化衍生之前,还需对含羰基或醛基的代谢物进行肟化衍生,减少糖类副产物的生成。
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参考问题1可知,限制LC-MS能力的主要是色谱分离。总结归类为脂质、胆汁酸、氨基酸、核苷酸等多数物质都可以使用LC-MS检测。
09
GC-MS和LC-MS两种平台各有优缺点。GC-MS平台对单糖、二糖、糖醇、有机酸(含三羧酸循环代谢物以及糖酵解中乳酸、丙酮酸)等代谢物检测具有极其优秀的色谱分离和定量稳定性优势,但是对分子量非常大或沸点非常高的代谢物往往无能为力,如脂质、酰基肉碱和酰基辅酶A就无法用GC-MS平台检测。
LC-MS平台本质上是性能非常强大的平台,只要样本制备方法和检测方法合适,该平台几乎能对所有物质进行检测,但需要高超的技术和多种方法配合使用。从覆盖面和经济性角度考虑,建议2种平台组合使用,否则需要根据自己的研究目的来选择。一般来说,对单糖、糖醇、中心代谢途径密切相关的代谢物、氨基酸、胆固醇比较关注的项目建议选择GC-MS平台或者谱领生物公司特色的HILIC-MS平台,而脂质组学、胆汁酸、酰基肉碱、酰基辅酶A、植物激素、动物类固醇激素等则选择LC-MS平台。对于测试平台的选择需要考虑的因素较多,也可以联系谱领生物技术支持获取更加准确的信息。
END
下一节,我们继续讲解代谢组学样本收集相关的基础知识。