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研究背景

肺动脉高压（PAH）可导致肺血管阻力增加、右心室功能障碍、和早死，是一种高死亡率的异质性疾病。

运用超高效液相色谱-质谱技术，能够检测和相对定量检测微量生物样本中数百种独特的代谢物，并构建广泛的代谢网络途径。这些代谢物可以区分生理和疾病状态。目前，很少对肺血管疾病患者进行代谢组学研究。下面小编和大家分享的文献，从多环芳烃患者肺组织中发现了异常氧化以及精氨酸和鞘氨醇代谢途径差异，通过呼出的挥发性化合物区分了严重特发性多环芳烃患者和健康志愿者。

实验设计

样本收集从2002年至2015年间，在伦敦哈默史密斯医院国家肺动脉高压服务中心就诊的特发性或遗传性多环芳烃患者，以及作为特发性和遗传性肺动脉高压国家队列研究（临床试验）一部分从英国其他国家中心招募的患者。对照血浆样本来自健康受试者和疾病对照受试者，后者是有症状的患者。见表1。

表1 实验样本取样研究设计表

实验方法：采用超高效液相色谱-质谱联用技术对血浆代谢物进行综合研究，以确定早期死亡的高危人群，确定对治疗反应良好的人群，为疾病的发病机制提供新的分子基础。

统计分析及结果讨论

为了防止异常值造成的结果偏差，对照组受试者和患者之间的初始组比较采用非参数U检验，以基于kolmogorov-smirnov检验的数据的最佳标准化为准，或者如果没有符合p>0.05的检验，则进行排序。未检测到代谢物的样品用代谢物的最低检测水平进行估算。

采用logistic回归分析确定诊断组之间独立区分的代谢物。采用正交偏最小二乘判别分析模型对这些代谢物进行了性能测试。R2分表示模型性能，Q2分基于交叉验证评估重复性（受试者分为7组，在7项分析的基础上预测其诊断）。用fisher精确试验对代谢产物的鉴别和预后进行了途径富集分析。

图1 分析流程图

研究人员再次采用了两组疾病对照受试者（n=70和69）的发现和验证设计。代谢物的一个子集（53个代谢物中的20个）在校正潜在混杂因素后将多环芳烃患者与疾病对照者区分开来。异差代谢物包括嘌呤、多胺和TCA循环代谢物的增加和磷胆碱和鞘磷脂的减少（图2A），通路网络显示中枢代谢物N2、N2dm2鸟苷和苹果酸的重要性（图2B）。

图2  区分肺动脉高压患者和对照组的代谢物

在发现和验证分析中，A和C图显示了健康对照组（HC）、多环芳烃患者、血管反应者和疾病对照组（DC）的个体模型分数。通过pah-hc（A）和pah-dc（C）比较的logistic回归选择代谢产物。B图和D图，为受试者工作特性曲线，显示模型在区分多环芳烃与HC和DC受试者方面的性能。AUC表示曲线下面积；ci表示置信区间。

在两个验证分析中，该模型对健康受试者和多环芳烃患者进行了分类，准确率分别为89%和84%。此外，发现队列中90%的多环芳烃血管应答者具有健康对照受试者典型的代谢物水平（图3A和3B），在2个验证分析中，该模型分别以69%和67%的准确率对疾病对照组和多环芳烃患者进行了分类（图3C和3D）。

图3 基于低代谢物数量的判别分析区分患者组与对照组

在对于多环芳烃血浆代谢产物存活分析研究中，研究人员假设与疾病病理生物学最密切相关的代谢物将与临床结果相关。为了确定与疾病进展和死亡率相关的代谢物，研究人员进行了生存分析。在发现和首次验证的PAH组中，116例患者中有28例死亡，75例患者中有25例死亡，平均随访时间分别为3.3±1.0年和4.5±4.0年，如上图所示。

第二个验证队列的患者随访时间不足以进行分析。在改变肌酐和利尿剂使用后，没有其他潜在的混杂因素与生存率相关。在686种定量良好的代谢物中，640种符合Cox回归分析的假设，其中62种在两种分析中都考虑了肌酐和利尿剂的使用后是预后的。3年随访的受试者操作特征分析证实这些代谢物具有预后，并确定了最佳截止值。

为了确定独立于当前预后的新途径的代谢物，研究人员将62种预后代谢物与3种先前发现的最能预测患者生存率的标记物进行了比较，62种代谢物中有36种与这些测量结果无关。（图4B）。

图4 与已确定的危险因素无关的预后代谢物

Venn图（图5）显示了3个队列中区分多环芳烃患者和健康对照组的代谢物与发现队列和首次验证队列中多环芳烃患者和健康对照组之间的logistic回归和预后代谢物之间的重叠。B图，在发现分析中，健康对照组（HC n=58）、多环芳烃幸存者（n=110，样本后3年存活）和非幸存者（n=24）之间显示了来自图A的19个重叠代谢物的聚类。红色表示多环芳烃患者与对照组相比代谢产物水平升高（蓝色表示代谢水平降低）。* 表示可能的代谢物特性，但没有经过验证。

上述分析确定并验证，，共有99种代谢产物在多环芳烃中具有鉴别或预后作用，代表25种代谢途径。特别是6条途径富含感兴趣的代谢物的途径，包括脂肪酸（酰基肉碱）、多胺和核苷代谢等。这些代谢产物中有16种既能鉴别多环芳烃，又能预测预后，这些代谢产物和其他3种通过logistic回归模型筛选出来的代谢产物能最好地区分多环芳烃患者和健康受试者，并聚集成确定的代谢途径。（图5）。

图5 肺动脉高压（pah）患者19种鉴别和预后代谢物的层次聚类分析

研究人员又分析了86名患者的样本，他们在第二个样本后至少随访了1年，两个样本之间的代谢物水平变化如图所示。存活者与非存活者的99种代谢物中27种的变化有显著性差异（p<0.05）。受试者工作特性曲线也证实了这些关联并确定了预测截止值（图6）。

图6A：受试者最后随访时代谢物水平和生存状态变化的操作特征分析。

图6B、D：最后随访时按生存状态分组的患者个体代谢物水平的变化。

图6C：kaplan-meier分析显示根据n-乙酰基的变化分组的肺动脉高压患者随时间的生存率-连续样本之间的蛋氨酸水平。

图6 连续样本分析

图7表示修饰核苷升高与血浆血管生成素升高的关系，在核糖核酸酶血管生成素切割转移核糖核酸酶后，修饰的核苷可在应激期间释放到循环中。为了确定这一机制是否与多环芳烃有关，研究人员在年龄和性别匹配的健康对照受试者和多环芳烃患者的代表性子集中测量了血浆血管生成素的含量。分析发现多环芳烃患者血浆中的血管生成素水平升高，与N2，N2-二甲基鸟苷水平有关。

结论

1、在本文的研究中，研究人员验证了多环芳烃患者色氨酸代谢途径的产物S14升高、色氨酸和酪氨酸增加的结果，但酪氨酸的变化与胆红素水平升高和肝功能不全有关，色氨酸及其其他主要代谢物5-羟色胺的水平没有明显改变。

2、循环修饰核苷（N2，N2-二甲基鸟苷，N1-甲基肌苷），TCA循环中间产物（苹果酸，延胡索酸），谷氨酸，脂肪酸酰基肌醇，和多胺代谢产物增加，类固醇，鞘磷脂和磷脂水平降低是多环芳烃患者区别于症状性多环芳烃的特征。无肺动脉高压的患者，循环代谢物水平的改善与更好的预后相关，可用于监测多环芳烃治疗的反应。

参考文献：Plasma Metabolomics Implicates Modified Transfer RNAs and Altered Bioenergetics in the Outcomes of Pulmonary Arterial Hypertension.