案例分享

原来普洱茶还有这些作用!

发布日期:2019.01.02 浏览次数(433)

寒冷的冬日,很多人喜欢手中捧一杯有益于健康的普洱茶慢慢品尝。普洱茶有抗氧化活性,有助于降低人体代谢物中的肌酐,从而可起到保护肾脏的作用。在饮用普洱茶后、人体内5-羟色氨酸(一种神经药物的中间体)水平升高,因而饮用普洱茶有助于预防头痛,减轻体重,缓解压力和失眠。普洱茶的一种特征成分茶褐素(TB)具有抗癌活性和调节血脂和降低胆固醇的功能;另一种特征成分没食子酸(GA)可降低人体血糖和血脂,并抑制HepG2细胞合成胆固醇。

普洱茶根据发酵工艺不同分为生茶和熟茶两种,生茶由晒青茶精制而成,熟茶则需经过渥堆、发酵的过程,并且一般认为普洱茶存放时间越长,茶的色泽味越好,生物活性作用也越强。让小编带大家来分享一篇经典的使用绿茶、红茶、普洱茶作为研究对象的代谢组学技术方面的文献。


摘要:茶叶加工的工艺差异导致茶叶(沏泡液)化学成分和茶叶沏泡液的颜色不同。此项研究使用化学分析方法分析和比较普洱茶(含不同年龄的普洱茶)、红茶、绿茶的化学成分差异。此研究还通过利用超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOFMS)并结合多变量统计技术研究了人体对普洱茶摄入的生物反应。 普洱茶摄入期间和之后的代谢改变的特征表现在尿液中5-羟色氨酸,肌醇和4-甲氧基苯乙酸的浓度升高,以及3-氯酪氨酸和肌酸酐的浓度的降低。 本研究突出表现了运用代谢组学技术评估营养干预的潜力,利用代谢组学研究普洱茶的代谢是迈向全面理解普洱茶对人体新陈代谢影响的重要一步。

前言:

茶(Camellia sinensis L.)是一种具有4000年历史的天然药物,现在它已成为世界上最受欢迎的饮料之一。  茶叶因具有诱人的香气,味道和通常被人们认为有益于健康而广受欢迎,并成为人们的理想的餐后饮料。

根据发酵程度,茶一般可分为三大类:未发酵的绿茶,部分发酵的乌龙茶和包种茶,以及完全发酵的黑茶和普洱茶。绿茶和乌龙茶主要在亚洲和北非为人们所饮用,而红茶的饮用范围遍及全世界。主产自中国云南省的普洱茶主要在亚洲,特别是在中国西南部,为人们所大量饮用。红茶和普洱茶都属于发酵茶; 然而,有研究报道像黑曲霉这样的微生物只在普洱茶发酵过程中被发现。普洱茶发酵过程中微生物氧化作用,比红茶发酵过程中的酶促氧化作用更彻底的将茶多酚氧化,这导致了导致普洱茶中茶多酚和儿茶素的浓度较低。

干燥的普洱茶成品通常被压成饼状或砖块状,以适合长期储存。此外,人们通常认为普洱茶的质量随着普洱茶年龄的增长而提高,而与普洱茶相对照的是,绿茶则是未发酵的茶,并且绿茶尽可能在新鲜时饮用更好。许多研究表明,普洱茶具有广泛的生物和药物特性,有研究分别报道了普洱茶的以下的活性:对于大鼠的降胆固醇作用;自由基清除作用;肺炎克雷伯菌支原体(Mycoplasma pneumoniae和口腔支原体(Mycoplasma orale的灭微生物活性;对百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis的杀菌活性;抗肥胖,抗突变和抗菌活性;降低大鼠血浆中大鼠血浆甘油三酯活性,降低大鼠中总胆固醇和降低低密度脂蛋白(LDL-cholesterol)胆固醇的作用;和防止低密度脂蛋白(LDL)氧化的作用。

据报道,利用不同的技术生产的不同种类的茶以及不同年龄的普洱茶的化学成分和药效都不同。在这项研究中我们试图区分各种茶的化学成分差异,确定各种年龄段普洱茶的质量的差异,并确定人类摄入普洱茶时通常的代谢反应。为此,我们应用了基于UPLC-QTOFMS技术的代谢组学方法。普洱茶的萃取液和人在摄入普洱茶后的体液样品的质谱检测图包含了极其丰富的组分信息,可以用来快速进行多种代谢物评估。为了分析UPLC-QTOFMS技术检测中生成的大量数据、并评估普洱茶摄入时各因素对体液代谢物数据的影响,需要运用精良最先进的计算机软件工具进行多变量统计分析,以探究人体对于普洱茶饮用生物反应,及其中涉及的代谢网络的完的整性,代谢系统的多样性、个体代谢反应的复杂性。有研究者使用基于核磁共振技术(NMR)和基于气质联用技术(GC-MS)的代谢组学成功地进行了绿茶的质量评估,并评估了饮用红茶、绿茶和洋甘菊对人体代谢的影响。在这项研究中,我们调查了绿茶、红茶、普洱茶之间的成分的差异,以及不同年龄的普洱茶的质量的差异;还运用UPLC-QTOFMS和结合多变量统计分析的代谢组学策略,分析了人体在6周时间内对普洱茶摄入的代谢反应。

材料和方法

化学品和材料 亮氨酸 - 脑啡肽,甲酸,茶氨酸,精氨酸和表儿茶素购Sigma-AldrichSt.LouisMO)。 HPLC级的乙腈和甲醇购自Merck(德国)获得。分析级甲醇购自上海林枫化学试剂有限公司(中国)。所有水溶液均用Milli-Q系统(18.2MΩMiliporeBedfordMA)生产的超纯水制备。杨梅素和茶黄素购自JK 化学品有限公司(中国上海)。儿茶素,表没食子儿茶素(EGC),表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG),没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和肌醇购自上海顺博生物工程有限公司(中国上海)。槲皮素,山奈酚,绿原酸和没食子酸购自国家药物和生物制品研究所(中国北京)。

有试验所采用的普洱茶,红茶和绿茶的信息,请参阅支持信息。正品普洱茶具有以下四个特点。它必须在云南省种植,尤其以在思茅区或西双版纳州种植的为好。必须使用属于野茶树(camellia sinensis)大叶茶树种的新鲜叶子作为原料,并且必须经过后发酵工艺处理以产生普洱茶独特的形状和固有特征。本研究之中使用的普洱茶的质量,经评估符合中国云南省茶叶地方标准DB53 / T103-2006的要求。

用于UPLC-QTOFMS分析的茶样品制备。将干燥的茶叶研磨成细粉并使用20目的筛网过滤。称量约约0.1g细茶粉(~0.1g)并标准化,并加入70%(v / v)甲醇(3mL)。然后将此茶粉末在60℃的超声波水浴中萃取60分钟。萃取的过程重复两次。冷却后,将溶液以13,000rpm离心15分钟,并将所得上清液立即储存在-80℃,直到UPLC-QTOFMS分析前。将超纯水(500μL)加入茶提取物(500μL)中并涡旋震荡1分钟,然后使用针头式滤器(0.22μm)过滤上清液以用于UPLC-QTOFMS分析。

茶色素的分析。茶色素的成分是复杂的成组的多种化合物,难以分离成单一化合物。因此,本研究采用文献中报道的系统方法进行主要茶色素的分析,分析的茶色素的种类包括:茶褐素(theabrownin /TB),茶黄素(theaflavin/TF)和茶红玉素(thearubigin/TR),并使用紫外 - 可见分光光度计(型号:UNIC UV-2102 PCSUNICUSA)进行定性和定量的测定。

实验的受试者与实验设计。将约5kg5年的普洱茶混合使样品均质化,然后将样品研磨成细粉并使用20目筛网过滤。使用200ml沸水沏泡通10g普洱茶粉末得到普洱茶液,并将茶液需过滤。实验的参与受试者每天饮用相当于5杯茶液的剂量。参与此研究的受试者的平均年龄为25岁(年龄的范围22-32岁),包括了的10名健康男性(n=10)和10名健康男性女性(n=10),共20人,每个受试者签署了书面的同意。

每天上午11:0011:30期间请受试者现场采集尿液样本,受试者参与实验的时间是为期6周,包括2周基线期,2周每日普洱茶摄取阶段和2后期阶段。在普洱茶摄取阶段,受试者在大约在每天的上午10点饮用200mL普洱茶。受试者饮用普洱茶后没有副作用。在实验期间受试者进食标准饮食,提以避免饮食对普洱茶的代谢结果的潜在影响。同时记录受试者的进食量和体重。

尿液样品制备。将收集的尿液样品在4℃以13,000rpm离心10分钟,并将所得上清液立即储存在-80℃。将超纯水(500μL)加入尿液样品(500μL)中并涡旋震荡1分钟,然后使用针头式滤器(0.22μm)过滤,处理后的样品用于UPLC-QTOFMS分析。

UPLC-QTOFMS分析。使用Waters ACQUITY 超高压液相色谱分析(UPLC)系统进行茶液成分的和尿液代谢物的分析,该系统配备有双相的流动相输送系统和样品进样的系统(Waters CorporationMilfordMA),色谱系统后面偶联与配备有电喷雾接口(Waters Corporation, Milford, MA)Micromass Q-TOF Premier质谱仪相。色谱分离采用2.1×100mm1.7μm ACQUITY BEH C18色谱柱。色谱柱的运行时的分离条件:45℃,流动相为1-99%乙腈(0.1%(v / v)甲酸) - 甲酸水溶液(0.1%(v / v)甲酸),以0.40 mL / min的流动速率梯度洗脱10分钟,。上样量5μL。依照之前我们文献中报道的优化条件选择质谱分析准确度和详细的质谱参数。在代谢物分析实验期间,对于每个样品,从501000Da获得质心数据,扫描时间为0.10秒,并且在10分钟的分析时间内具有0.01秒的扫描间延迟。

数据处理和统计分析。 分析尿样的质谱(UPLC-QTOFMS)数据以识别潜在的差异代谢物。 在使用MarkerLynx版本4.1WatersManchesterU.K。)的软件分析电喷雾质谱(ES +)原始数据时,使用我们之前的工作中报到的参数。 对于每一个样品的多峰值强度排列表,使用保留时间(RT)和核质比(m / z)数据对作为每个峰的标识符。得到的三维矩阵包含样品名称(观察值)、任意峰的(保留时间-核质比m / z对),和峰值强度信息等多个数据参数,将此信息导入到SIMCA-P软件11.0UmetricsUmea˚Sweden),以进行于多变量统计分析。 使用先前报道的方法进行基于质谱(UPLC-QTOFMS)分析的多变量统计分析。

结果和讨论:

茶叶样品的成份分析。用我们先前研究中报道的代谢组学分析方法,我们用UPLC-QTOFMS结合多变量统计分析方法分析了普洱茶,红茶和绿茶的成份。图1A Figure 1A呈现的是普洱茶,红茶和绿茶的UPLC-QTOFMS基峰强度色谱图(base peak intensity chromatogramsBPI)。通过直观的目测这个UPLC-QTOFMS色谱图(Figure 1A发现,各样品之间的差异不明显。然而,通过应用多变量统计分析, 得到了图1B(Figure 1B)的正交偏最小二乘方方判别分析图(OPLS-DA),图中三种类型茶叶的数据呈现明显的分离。在图1B(Figure 1B)的正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)图中,三类茶叶的数据所处的区域分离良好,这表明绿茶、普洱茶、红茶和绿茶在化学成分上有差异。

代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 1. Comparison of UPLC-QTOFMS base peak intensity (BPI) chromatograms (A) and scores plot (t[1] vs t[2]) generated from OPLS-DA of UPLC-QTOFMS spectra of pu-erh teas (), black teas (), and green teas () (B).

红茶、绿茶和普洱茶这三种茶的化学成分不同(参见支持信息表S2)。表1、表2总结了三种茶叶成份的差异,其中包含了多种茶色素类物质(如茶黄素)、多种儿茶酚(catechin)类物质(如表没食子儿茶素没食子酸酯)的浓度差异。图2和图3则揭示:三种茶叶的主要茶色素-茶褐素(TB)、茶黄素(TF)和茶红玉素的含量(TR)显著不同,并且三种茶叶的多种儿茶酚类物质的含量也明显的不同。此外,本研究还分别比较了普洱茶-红茶, 普洱茶-绿茶,以及红茶-绿茶的这三组茶叶的化学成分的差异,比较的项目涉及了堪非醇和儿茶酚类物质(详见支持信息中的图S1-S3、表S3-S5)。研究发现绿茶中的特征成分是茶多酚类物质和茶氨酸,红茶的特征成分是茶黄素(TF)和茶红玉素(TR),普洱茶的特征成分是茶褐素(TB)和没食子酸(GA)(图2)。在普洱茶发酵过程中,儿茶酚含量逐渐减少,因此在普洱茶中儿茶酚含量比红茶和绿茶中都低。伴随着普洱茶的发酵, 表没食子儿茶素(epigallocatechin EGC),表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate EGCG)表儿茶酸(epicatechin, EC)等些儿茶酚类物质在普洱茶中几乎检测不到(图3)。随着发酵的进行,茶多酚类物质、儿茶酚类物质,茶黄素(TF),茶红玉素(TR),氨基酸类物质和可溶性糖的含量大幅度的减少,然而,茶褐素(TB)含量却增加了。与红茶相比,普洱茶几乎不含茶黄素(TF)或茶黄酸(TFA)等使茶叶具有涩味和苦味的物质。

Table 1. The Contents of Tea Pigments in Different Teas

sample no.

type

preservation period (yr)

TF (%)

TR (%)

TB (%)

1

pu-erh tea

1

0.29

0.36

8.33

2

pu-erh tea

3

0.23

0.99

8.75

3

pu-erh tea

5

0.22

0.76

8.95

4

pu-erh tea

8

0.21

0.75

9.29

5

pu-erh tea

     10

0.25

0.73

10.72

6

pu-erh tea

1

0.20

0.76

11.92

7

pu-erh tea

5

0.19

0.47

9.82

8

pu-erh tea

1

0.21

0.83

8.91

9

pu-erh tea

2

0.21

0.43

11.25

10

pu-erh tea

5

0.23

0.27

8.88

11

pu-erh tea

8

0.19

-a

13.65

12

pu-erh tea

10

0.16

-a

11.30

13

black tea

1

0.37

8.84

6.66

14

black tea

1

1.11

10.00

8.56

15

black tea

1

0.47

8.33

7.19

16

black tea

1

0.31

8.20

7.29

17

green tea

0.5

0.14

4.90

3.26

18

green tea

1

0.16

4.36

2.78

19

green tea

1

0.23

5.49

5.49

20

green tea

1

0.22

5.03

2.67

21

green tea

1

0.21

4.67

2.87

22

green tea

1

0.19

5.32

3.50

23

green tea

0.5

0.18

3.28

2.17

 24green tea           0.50.12 3.132.12

a Not detected


Table 2. The Contents of Determined Constituents in Different Teas (µg/mL)

sample no.

type

preservation period (yr)

TFA

C

CG

GCG

EGC

EC

ECG

quercetin

1

pu-erh tea

1

0.75

-a

-

8.29

1.82

9.06

9.89

1.14

2

pu-erh tea

3

1.11

0.25

-

10.80

3.79

21.13

10.66

1.22

3

pu-erh tea

5

4.34

1.35

-

8.29

4.98

44.36

18.21

1.30

4

pu-erh tea

8

4.16

1.32

-

8.85

5.17

40.26

11.35

1.18

5

pu-erh tea

10

4.05

1.31

-

8.29

5.62

35.88

8.19

1.16

6

pu-erh tea

1

35.65

10.86

207.48

163.00

70.24

114.41

537.14

3.93

7

pu-erh tea

5

28.34

4.82

180.96

90.50

34.01

75.04

471.65

5.94

8

pu-erh tea

1

0.39

-

-

8.29

1.26

-

8.19

0.94

9

pu-erh tea

2

0.25

-

-

8.29

1.26

2.51

8.19

0.99

10

pu-erh tea

5

0.70

-

-

8.29

1.56

6.30

8.19

0.98

11

pu-erh tea

8

0.23

-

-

8.16

1.33

6.02

8.02

0.91

12

pu-erh tea

10

0.23

-

-

8.23

1.26

5.68

7.87

0.89

13

black tea

1

21.94

0.70

37.06

57.60

10.57

36.50

116.20

5.82

14

black tea

1

33.12

0.36

19.02

23.10

6.86

15.85

71.64

0.84

15

black tea

1

34.73

-

-

13.00

2.10

0.16

11.32

0.84

16

black tea

1

30.50

-

1.60

19.30

3.18

6.62

28.63

0.84

17

green tea

0.5

43.58

3.32

174.16

315.00

47.23

85.65

454.84

2.73

18

green tea

1

29.19

1.61

81.55

238.00

97.10

72.33

226.11

1.93

19

green tea

1

24.71

2.62

154.41

338.00

95.44

55.21

406.06

4.72

20

green tea

1

39.25

5.58

236.62

298.00

91.86

114.78

609.12

4.81

21

green tea

1

37.87

6.40

255.32

350.00

122.19

97.21

655.30

7.65

22

green tea

1

44.31

3.60

116.64

225.00

127.12

87.10

312.77

4.70

23

green tea

0.5

44.24

3.10

123.62

337.00

157.21

95.55

330.01

2.36

     24green tea            0.547.803.89168.57269.00 58.1474.69441.032.72

a Not detected

茶色素具有某些类似药物的特性,例如茶色素具有抗癌活性和调节血脂和降低胆固醇的功能。普洱茶发酵过程中茶褐素(TB)的增加使普洱茶具有的棕色,但对于茶褐素的类似于药物作用的机制迄今为止还没有得到阐明。没食子酸(GA)是普洱茶发酵过程中表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)降解的主要产物之一,是普洱茶的另一种活性成分。据报道,没食子酸(GA)可降低人体血糖和血脂,并抑制HepG2细胞合成胆固醇。我所发现的在普洱茶中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量降低和没食子酸(GA)含量增加与先前的研究的结果一致。普洱茶发酵过程使没食子酸(GA)含量增加,此发现可以解释普洱茶的降胆固醇作用。

代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 2. The contents of tea pigments in pu-erh teas (◆), black teas (●), and green teas (△). 


代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

 Figure 3. The contents of TFA, C, CG, GCG, EGC, EC, ECG, and quercetin in pu-erh teas, black teas, and green teas.   


代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 4. PLS-DA scores plot of pu-erh tea of different ages: 1-, 3, 5-, 8-, and 10-year-old.

如上所述,据报道较长时间的老化改善了普洱茶的质量。因此,我们收集了不同年龄的普洱茶,使用UPLC-QTOFMS结合多元统计分析方法,并运用我们以前研究所采用的预处理方法,检测和分析了不同年龄的普洱茶。 UPLC-QTOFMS检测得到的数据进行双组分偏最小二乘方分析(PLS),图4Figure 4)的偏最小二乘方分析(PLS)得分图描绘了不同的年龄的普洱茶成分的一般化学变化。表3 Table 3 中则列出了导致不同年龄普洱茶数据分离的差异化学物质。图5 Figure 5. 中详细比较了1年和10年的普洱茶的差别。仅仅凭目测直接观察不同年龄普洱茶样品的UPLC-TOFMS 基峰信号强度色谱图(BPI) ,不能发现明显的数据信息的差异(BPI图没有在文中呈现)。而采用偏最小二乘方分析法(PLS)分析数据,可看到在图4PLS得分图,通过PC1参数项可容易地判定不同年龄的普洱茶数据分离。从图4还可以看出,1岁和3岁的普洱茶样品的某些化学成分浓度不同,并且两种普洱茶中这些化学成分的浓度与5岁,8岁和10岁的普洱茶也不同。 5岁,8岁和10岁的普洱茶的数据有分离但数据的分离较不明显,这可能表明,虽然普洱茶的化学成分组成(和质量)随时间而变化,但一定时间后逐渐趋于稳定。因此,此研究选择了5岁普洱茶用于研究人饮用普洱茶的生物学反应。

Table 3. Summary of the Differential Metabolites from VIP Values of Two Component PLS-DA Model (R2Y ) 0.982, Q2Y ) 0.946) of Pu-erh Tea

(10 Year)a

metabolite identification

VIP

glucose

(5)

caffeine

(1)

kaempferol

(2)

gallocatechin

(4)

catechin

(3)

epicatechin

(7)

arginine

(6)

                    theanine(8) 

a Compared to the pu-erh tea (1 year), represents significantly elevated concentration, whereas represents significantly lowered concentration.


 

代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 5. Metabolic profiles depicted by PLS-DA scores plot of UPLC-QTOFMS spectra between samples of pu-erh tea (1 year) and pu-erh tea (10 year). 


代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 6. Comparison of UPLC-QTOFMS base peak intensity (BPI) chromatograms of urine collected during the predose phase (A), pu-erh tea intake phase (B), and postdose phase (C).

尿液样品制备的优化。 UPLC-QTOFMS技术分析之前,参照Plumb等人的方法,使用超纯水或0.1%甲酸(v / v)水溶液稀释尿液样品。 详细的实验参数在支持信息有呈现。 在支持信息中还呈现了不同的稀释体积对代谢物分析结果的影响,伴随的UPLC-QTOFMS基峰信号强度色谱图(BPI)一并呈现在支持信息中。 通过检查基峰信号强度色谱图(BPI)发现,在条件S1下,在保留时间为3.79分钟时,峰值是饱和的。在条件S3下,在保留时间为79分钟之有多峰值信号。 还研究了分别用水和0.1%甲酸溶液稀释样品,对样品检测峰信号的影响,但发现稀释样品对样品峰信号分离的改善不大。 因此,最终采用两倍体积的水稀释尿液样品。 

尿液UPLC-QTOFMS图谱的分析。 如图6所示(Figure 6. ),仅通过目测检查普洱茶摄入之前,期间和之后从男性参与者的尿液的UPLC-QTOFMS基峰信号强度色谱图(BPI)难以发现明显的数据差异,尽管各样品BPI图谱中某些峰强度有差异。我们随后使用了统计学分析方法,以明确的解析普洱茶摄入前后的细微代谢差异。

如图7 Figure 7主成分(PCA)分析图所示,此研究对所有尿液代谢物谱进行主成分分析(PCA)(图7)。第14天的尿液的样品因为参与者当天没有吃标准饮食,此样品数据被作为溢出值剔除。主成分分析(PCA)得分图显示了在摄取普洱茶之前,期间和之后获得的受试者尿液样品代谢物数据的聚类分析。 相应的主成份分析载荷图和S-(S-plot)显示,导致代谢数据产生聚类的主要的差异代谢物因素包括尿液中肌醇,肉豆蔻酸,5-羟色氨酸和4-甲氧基苯乙酸浓度的增加,及肌酸酐,3-氯酪氨酸和酪胺浓度的减小,参见表4Table 4)。

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Figure 7. Trajectory of PC1 vs PC2 scores for UPLC-QTOFMS data of urine samples collected during the predose phase, pu-erh tea intake phase, and postdose phase. Each dot denotes mean score at different time points (e.g., predose period (day 1, day 7), “dosing” period (day 16, day 21, day28), and postdose period (day 30, day 36, day 42)


Table 4. Changes of Metabolites Observed in Human Urine Obtained after Pu-erh Tea Intake and the Contribution of Each Metabolite.

retention time(min)

metabolite

VIP rank

0.97

inositol

3()

1.45

myristic acid

4()

2.01

5-hydroxytryptophan

5()

2.19

4-methoxyphenylacetic acid

1()

0.71

creatinine

8()

1.03

3-chlorotyrosine

7()

1.15

tyramine

6()

            2.01pyroglutamic acid  2()

represents significantly elevated concentration, whereas represents significantly lowered concentration.

普洱茶摄入的影响。 在这项研究中,对10名男性和10名女性在普洱茶饮用期之前(第1,714天),普洱茶饮用期间(第16天,第21天和第28天)以及普洱茶饮用期之后,(第30,3642天)的尿液样品使用UPLC-QTOFMS技术进行了分析。 典型的样品的基峰信号强度色谱图(BPI)如图6Figure 6. )所示。 主成分分析法(PCA),作为一种是一种无监督模式判别法,在本研究中采用以提高分析的准确度。图7的主成分分析PCA得分图的轨迹揭示受试者在摄取普洱茶之前,期间和之后尿液中代谢物的数据明显被参数主成分1PC1)分离。三种样品由主成分1PC1)清楚地分开; 该图还显示,受试者饮用普洱茶期间,受试者得的代谢数据相对于饮用普洱茶之前的数据偏离基线(由参数PC1决定),在停止服用普洱茶后受试者代谢数据又返回基线,尽管如此受试者停止饮用普洱茶之后的数据仍然不同于饮用普洱茶之前的数据。


代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 8.  Scores plot (t[1] vs t[2]) generated from OPLS-DA of UPLC-QTOFMS spectra from control


代谢组学-脂质-代谢流-靶向定量

Figure 9.  S-plot of the differentiate metabolites.

我们在随后构建三组分偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)模型(R2X0.606R2Y0.927Q2Y0.821)以判定决定对照组和普洱茶摄取组的代谢模式的分离的差异代谢物。 4总结了决定尿液中代谢谱差异的差异代谢物组。人尿液代谢物受性别影响,如图8所示(Figure 8)普洱茶摄入过程中男性和女性受试者的代谢产物可以由 PC2t [1])显著的分离,这一点已经由Wang等人讨论过。另有研究报道,普洱茶代谢的尿液数据可因饮食和收集时间差异而产生数据分离。 所有这些因素对代谢特征的影响都会模糊普洱茶饮用这一特定饮食干预的代谢效果。 为了确定专门针对普洱茶的代谢变化,我们建立了标准饮食和固定的尿液样品的收集时间。

使用S-plot模型来呈现普洱茶摄入前和普洱茶摄入期间的差异代谢物,见图9Figure 9)。表4列出了重要的差异代谢物及其变化重要性参数VIP值,VIP值是表征变量对模型的影响的程度的度量数值。最重要的影响因素包括尿液中4-甲氧基苯乙酸、肌醇、肉豆蔻酸和5-羟色氨酸的浓度增加,以及尿液中3-氯酪氨酸、酪胺、肌酐的浓度的降低(图9和表4)。据报道、肌糖(纤维醇)可以降低胆固醇水平,因此普洱茶摄入过程中尿液代谢物中肌醇水平的增加可以部分解释文献中报道的普洱茶降胆固醇作用。 3-氯酪氨酸是髓过氧化物酶催化氧化的特异性标志物,3-氯酪氨酸的浓度在从人动脉粥样硬化血管分离的低密度脂蛋白(LDL)中显着升高。3-氯酪氨酸水平的降低是低密度脂蛋白(LDL)浓度降低的表征,也说明了普洱茶降低血浆甘油三酯的机制。 5-羟色氨酸作为必需氨基酸—色氨酸,以及5-羟色胺(血清素)生物合成的中间体,可提高5-羟色胺水平,从而有助于预防头痛,减轻体重,缓解压力和失眠。 5-羟色氨酸也是临床上重要的神经药物。观察到肌酐浓度减少的原因尚不清楚。然而,众所周知,氧化反应激促进肌酐从尿液排泄,据报道抗氧化剂可减少兔的尿肌酐。因此,普洱茶的抗氧化活性可能导致普洱茶摄入后尿液中肌酐水平降低。

对比在普洱茶摄入期后的2周内与普洱茶摄入前的两周的尿液样品(图8支持信息图参见图S6(Figure 8 Figure S6)发现:受试者在普洱茶摄入期结束后两周,尿液代谢数据没完全恢复到摄入普洱茶前的水平。这一个现象可以用普洱茶对肠道微生物菌群的抗菌活性来解释。已经有研究显示尿液中肌酸酐和其他代谢物质的浓度受微生物调节。报道3-氯酪氨酸有促进肠道微生物生长的活性,3-氯酪氨酸在普洱茶摄取阶段的在尿液中浓度的减少可能促使了肠道微生物的减少。有研究已经证明普洱茶具有抗菌活性,因此摄取普洱茶后可能需要超过2周的时间来重新建立肠道微生物群。肠道微生物对肠上皮的发育和结构,对于肠道的消化和吸收能力以及宿主免疫系统功能产生深远的影响;因此,此研究的结果预示着饮用普洱茶会影响肠道微生物群进而对人体的健康产生影响。确定在普洱茶摄入过程中受试者肠道微生物群落的变化将有助于了解普洱茶饮用的功能。

总之,我们应用基于质谱(MS)技术的代谢组学方法来评估了普洱茶、红茶和绿茶的组成成分,以及饮用普洱茶的生物学效果。我们发现茶叶加工过程的差异导致茶叶化学成分和茶叶沏泡液颜色的不同。绿茶的特征成分为多酚和茶氨酸,红茶的特征成分为茶黄酸(TFA)和茶红玉素(TR),普洱茶的特征成分为茶褐素(TB)和没食子酸(GA)。我们还发现尿液中代谢物数据特征受到饮用普洱茶这一饮食干预的影响,在普洱茶摄入期间尿液中代谢物数据偏离基线,并且在2周洗脱阶段尿液中代谢物数据回归到接近基线的模式。结果发现,尿液中肌酐浓度的降低和4-甲氧基苯乙酸,肌醇,肉豆蔻酸,5-羟色氨酸的浓度的升高与普洱茶的摄入量密切相关。此外,普洱茶摄入的代谢后果在普洱茶摄入期之后的2周内持续存在,普洱茶摄入期后的肠道菌群微生物区系没恢复到摄入前的水平。此研究是朝着全面了解普洱茶及其对人体新陈代谢的影响迈出的重要一步。并且有必要来进一步进行药理学研究以阐明普洱茶的代谢作用。 

缩写的解读

UPLC-QTOFMS,超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱; PCA,主成分分析;PLS-DA,偏最小二乘方判别分析; ANN,人工神经网络; BPI,基峰强度; VIP,变量重要性参数;EGC,表没食子儿茶素; EGCG,表没食子儿茶素没食子酸酯; ECG,表儿茶素没食子酸酯;GCG,没食子儿茶素没食子酸酯;TR,茶红玉素; TF,茶黄素;TFA,茶黄酸; TB,茶褐素; GA,没食子酸。

致谢

我们感谢志愿者帮助完成这项研究。

可获得的支持信息:茶样品的来源(表S1/ Table S1;普洱茶,红茶和绿茶的化学成分比较(表S2/ Table S2; 通过双组分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.994Q2Y=0.991)判别绿茶中(与红茶相比较)的VIP值的差异代谢物的总结表见表S3Table S3),↑代表显着升高的浓度,而↓代表显着降低的浓度); 通过双组分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.999Q2Y=0.995)判别红茶中(与普洱茶相比)的VIP值的差异代谢物的总结表见表S4Table S4),↑代表显着升高的浓度,而↓代表显着降低的浓度);通过双组分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.999Q2Y=0.995)判别绿茶中(与普洱茶相比)的VIP值的差异代谢物的总结表见表S4Table S4),↑代表显着升高的浓度,而↓代表显着降低的浓度);尿液稀释参数见表S6(Table S6)使用偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)得分图描述绿茶和红茶样品之间的UPLC-QTOFMS色谱检测代谢谱差异见图S1Figure S1);使用偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)得分图描述描述普洱茶和红茶样品之间的UPLC-QTOFMS色谱检测代谢谱差异见图S2Figure S2); 使用偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)得分图描述普洱茶和绿茶样品之间的UPLC-QTOFMS色谱检测代谢谱差异见图S3Figure S3);用不同体积的超纯水稀释的尿液样品的UPLC-QTOFMS基峰强度(BPI)色谱图见图S4Figure S4);用2倍体积的超纯水和0.1%甲酸溶液稀释的尿液样品的UPLCQTOFMS基峰强度(BPI)色谱图见图S5 Figure S5);对普洱茶摄取期间和普洱茶摄入后的UPLC-QTOFMS代谢普数据进行正交偏最小二乘方判别(OPLS-DA)分析(t [1] vs t [2])的得分图见图S6Figure S6)。这些资料可通过互联网免费获取,网址为http://pubs.acs.org

 

文献内容

Title: Characterization of Pu-erh Tea Using Chemical and Metabolic Profiling Approaches

Author: GUOXIANG XIE, MAO YE, YUNGANG WANG, YAN NI, MINGMING SU, HUA HUANG, MINGFENG QIU, AIHUA ZHAO, XIAOJIAO ZHENG, TIANLU CHEN, AND WEI JIA

Journal:  J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3046–3054

Keywords: UPLC-QTOFMS; pu-erh tea; metabonomics; multivariate statistical analysis

Abstract
In this study, the chemical constituents of pu-erh tea, black tea, and green tea, as well as those of pu-erh tea products of different ages, were analyzed and compared using a chemical profiling approach. Differences in tea processing resulted in differences in the chemical constituents and the color of tea infusions. Human biological responses to pu-erh tea ingestion were also studied by using ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOFMS) in conjunction with multivariate statistical techniques. Metabolic alterations during and after pu-erh tea ingestion were characterized by increased urinary excretion of 5-hydroxytryptophan, inositol, and 4-methoxyphenylacetic acid, along with reduced excretion of 3-chlorotyrosine and creatinine. This study highlights the potential for metabonomic technology to assess nutritional interventions and is an important step toward a full understanding of pu-erh tea and its influence on human metabolism.

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