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灰黄霉素诱导小鼠肝损伤的代谢组学研究

发布日期:2019.09.18 浏览次数(20)

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灰黄霉素(GSF)在小鼠中引起肝卟啉症,其原理是模拟了人类红细胞生成原卟啉(EPP)相关的肝损伤。目前的研究使用代谢组学方法研究了GSF诱导的小鼠肝损伤的生化基础。小鼠中的GSF处理导致肝脏中原卟啉IX(PPIX)、N-甲基PPIX、胆汁酸和谷胱甘肽(GSH)的显着增加。

代谢组学分析揭示了GSF的生物活化途径,其促进GSF-PPIX、GSF-GSH和GSF-脯氨酸加合物的形成。N-甲基PPIX强烈抑制铁螯合酶,这是将PPIX转化为血红素的酶,并导致PPIX积累。肝脏中过多的PPIX导致胆管阻塞并扰乱胆汁酸的稳态,GSH在肝脏中的积累可能是由于Nrf2介导的GSH合成的上调。总的来说,本研究提供了GSF诱导的肝损伤的生化基础,可用于了解人类EPP相关肝损伤的病理生理学。下面就为大家详细地分享这篇代谢组学文献。

引言


灰黄霉素(GSF)在动物和人类中用于治疗真菌感染。GSF会引起多个副作用,包括混乱、头晕、恶心、腹泻以及疲劳有关的副作用。GSF上调δ-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)的表达,从而导致小鼠患肝卟啉症。ALAS是血红素合成途径中的限速酶,可增加卟啉的产生。此外,GSF处理铁螯合酶(FECH)导致的功能缺陷,这是将原卟啉IX(PPIX)转化为血红素的酶,因此GSF在小鼠的治疗中会出现肝损伤的现象。这种表型是类似于与红细胞生成性原卟啉人类受试者(EPP)相关的肝损伤。因此,GSF通常用作工具药来产生,用于调查EPP相关的肝损伤。

在小鼠GSF研究中,我们发现肝细胞损伤,胆汁淤积,胆管增生和肝硬化。此外,在用GSF治疗的小鼠肝脏中观察到氧化应激。全基因谱分析显示GSF的基因改变可能与炎症,纤维化和胆汁淤积有关。尽管如此,GSF诱导的肝损伤的生化基础仍未得到充分研究。目前的研究使用代谢组学方法在小鼠中解决了这两个问题:(1)GSF在肝脏代谢组中的改变; (2)GSF如何引起肝脏代谢组的变化。

材料及方法


实验试剂

灰黄霉素(GSF)、原卟啉IX(PPIX)、N-甲基PPIX、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽(GSH)和L-脯氨酸(PRL)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) 。胆汁酸的化学标准品得自Steraloids,Inc。(Newport,RI)。用于超高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOFMS)分析的所有溶剂均为市售的最高级别。


实验动物及处理

给FVB / NJ小鼠(雄性,8周龄)喂食2.5%GSF饮食(w / w)或对照饮食(每组n = 4)14天。基于先前的研究,显示出肝损伤小鼠[选择GSF治疗的剂量和时间16,18 ]。在治疗的最后一天,将小鼠分别圈养在代谢笼中以收集尿液和粪便。然后,处死所有小鼠并收获肝组织。将一部分肝组织固定在4%甲醛磷酸盐缓冲液中。将剩余的肝组织在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。


生化和病理分析

进行生化分析以测量血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)活性。对于病理分析,将固定的肝组织在连续浓度的醇和二甲苯中进行脱水,然后进行石蜡包埋。切割4微米切片的肝组织并用苏木精和曙红染色。


代谢物分析和样品制备

20μl血清样品用75μL的甲醇中,然后在15000rpm转速涡旋30秒,并离心混合 10分钟。再将肝脏样品在水中均质化(在400μl水中的100mg组织),然后将200μL等分试样的甲醇加入到100μL肝匀浆中。将混合物1分钟涡旋两次,并在15,000rpm转速离心 20分钟。尿液样本通过50μL尿液与100μL乙腈混合,然后以15,000rpm转速离心制备 10分钟。粪便在水中均质化,然后将200微升的乙腈:甲醇(1:1,V / V)加入到所得到的200μL混合物中,然后在15000rpm转速离心持续10分钟。将上清液转移到新的Eppendorf小瓶中进行第二次离心。将1微升上清液注射到UPLC-QTOFMS系统上进行代谢物分析。


GSF的体外代谢

孵育在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4)中进行,其含有10μMAFF和0.1mg小鼠肝微粒体(XenoTech,LLC,Lenexa,KS),体积为190μL。孵育一式三份进行。在37℃温育5分钟后,通过加入10μL的20mM NADPH(终浓度1.0mM)引发反应,并在轻轻摇动下继续40分钟。GSH或PRL(终浓度5.0mM)用于捕获反应性代谢物。温育通过加入冰冷的200μL甲醇终止,然后涡旋30秒和在15,000rpm转速离心克 10分钟。将1微升上清液注射到UPLC-QTOFMS系统上进行代谢物分析。


UPLC-QTOFMS分析

代谢物的色谱分离在Acquity UPLC BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm; Waters Corporation,Milford,MA)上进行。流动相A(MPA)在水中为0.1%甲酸,流动相B(MPB)在乙腈中为0.1%甲酸。梯度从2%MPB开始并保持1分钟,然后是12分钟线性梯度至95%MPB,保持8分钟,然后降低至2%MPB用于柱平衡。流动相的流速为0.5ml / min,柱温保持在50℃。QTOFMS系统(Waters Corporation,Milford,MA)以高分辨率模式(分辨率~20,000)进行电喷雾电离。源和去溶剂化温度分别设定在150℃和500℃。施加氮气作为锥形气体(50L / h)和去溶剂化气体(800L / h)。氩气用作碰撞气体。毛细管和锥形电压设定为0.8kV和40V。用甲酸钠校准QTOFMS,并通过间歇注射锁定质量的亮氨酸脑炎实时监测(m / z = 556.2771)。


数据分析

质谱由MassLynx 4.1(Waters Corporation,Milford,MA)以质心格式从m / z 50至1000获得。通过下式生成包含样品同一性,离子同一性(保留时间和m / z)和离子丰度的多变量数据矩阵。 deisotoping,反卷积,峰值对齐,识别和整合。然后将数据矩阵导出到SIMCA-P +(版本13,Umetrics,Kinnelon,NJ)并通过均值中心和Pareto缩放进行变换。进行主成分分析(PCA)以分析不同处理组之间的自然相互关系。进一步地进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)以最大化类别辨别。


统计分析


所有量化数据表示为平均值±SD。组间的统计学显著性通过双尾学生t检验确定。当P小于0.05的值被认为是统计学显著(本代谢组学实验由上海谱领生物科技有限公司完成)。

研究结果


GSF诱导的小鼠肝损伤

与对照组相比,GSF治疗导致血清ALT和ALP水平显著增加(图1A和1B),表明混合的肝细胞 - 胆汁淤积性损伤。GSF治疗也导致肝脏肿大,因为GSF组肝脏与体重比显着增加(图1C)。正如预期的那样,在GSF处理后,PPIX在小鼠肝脏中显着积累(图1D)。通过组织学分析,我们观察到胆汁栓塞以及用GSF治疗的小鼠肝脏中的炎症(图1F),表明胆管阻塞。这些生化和病理改变小鼠类似于在GSF性肝损伤以往的研究。

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图 1


GSF干扰小鼠的肝脏代谢组

PCA分析显示对照组和GSF组之间肝脏代谢组的明显差异(图2A)。OPLS-DA分析显示有助于该组分离的离子,包括胆汁酸,PPIX和GSH(图2B)。胆汁酸也是用GSF治疗的小鼠血清中排名最高的离子(图2C)。此外,代谢组学分析鉴定了肝脏和血清样品中的GSF代谢物。此外,在用GSF处理的小鼠的肝脏中观察到N-甲基PPIX的积累。总体而言,GSF处理导致肝脏中PPIX,N-甲基PPIX,胆汁酸和GSH的显着增加(表1)。

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图 2


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表 1


胆管阻塞和胆汁酸积聚

肝脏是胆汁酸合成和稳态。我们用GSF(经处理的小鼠的肝脏观察到的胆汁酸显著积累图2B和图3A)。我们接下来测试了肝脏中胆汁酸的积累是否是由于编码参与胆汁酸稳态的酶和转运蛋白的基因的调节。促进胆汁酸合成的酶包括胆固醇7ɑ羟化酶(Cyp7a1基因),8β羟化酶(CYP8B1)和固醇27羟化酶(CYP27A1)。GSF处理对Cyp7a1表达无影响,但下调Cyp8b1和Cyp27a1的表达(图3B))。对于转运蛋白,GSF治疗对多药耐药相关蛋白2(Mrp2)的表达没有影响,后者是泵出胆红素的转运蛋白。然而,我们观察到胆汁盐输出泵(Bsep)的上调和Na + -牛磺胆酸盐协同转运多肽(Ntcp)的下调(图4B),这两种转运蛋白分别参与胆汁酸的外排和摄取。Bsep的增加和Ntcp的减少被认为是对阻塞性胆汁淤积的适应性反应。我们观察到用GSF治疗的小鼠胆管阻塞(图1F)。因此,我们得出结论,GSF介导的肝脏中胆汁酸的富集是由胆管阻塞引起的,而不是由胆汁酸合成引起的。这种机制得到以下事实的支持:在用GSF处理的小鼠的血清中观察到显着的胆汁酸积累(图2C和图3C),其中胆汁酸排泄途径被阻断。

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图 3


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图 4


谷胱甘肽(GSSG)

GSH是主要的内源性抗氧细胞[保护对抗氧化应激 ]。我们预计在GSF治疗的小鼠的肝脏GSH耗竭和GSSG积累,因为PPIX导致氧化应激。令人惊讶的是,GSH水平在GSF处理的小鼠的肝脏中没有降低,但是显着增加(图4A)。此外,对照和GSF处理的小鼠之间的GSSG水平没有显着差异(图4B)。我们进一步检测了谷氨酸 - 半胱氨酸连接酶(Gcl)的表达,这是GSH生物合成中的限速酶。GSF处理后Gcl显着上调(图4C)。GCL,NADH醌氧化还原酶-1(NQO1)和血红素加氧酶1(HMOX-1)是Nrf2的,调节抗氧化剂蛋白质[的表达的转录因子的靶基因]。我们发现GSF处理后Nqo1和Hmox-1的表达也显着上调(图4D和4E),表明Nrf2是由GSF诱导的肝损伤引发的。

 在用GSF处理的小鼠的肝脏,血清,尿液和粪便中筛选GSF代谢物。总的来说,22种代谢产物进行了鉴定,包括9组先前报道的代谢物和13种新颖代谢物(表2,图5)。在这些GSF代谢物中,一种PPIX-缀合的(M17),一种GSH-缀合的(M18),三种半胱氨酸缀合的(M19-21)和一种PRL-缀合的(M22)代谢物是令人感兴趣的,因为它们与GSF的途径相关。生物活化(图5)。

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图 5


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表 2


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图 6

通过使用GSH或PRL作为捕获试剂,我们在GSF与小鼠肝微粒体的孵育中概括了GSF-GSH和GSF-PRL加合物(图6D和6E)。此外,我们证实GSF-GSH和GSF-PRL加合物的形成是NADPH依赖性的,表明这些GSF的生物活化途径是由CYP450形成的。此外,我们发现用GSF处理的小鼠肝脏中的N-甲基PPIX增加了6.3倍(图6F)。GSF-PPIX是前体Ñ甲基PPIX,其可强烈抑制FECH并导致PPIX积累。


结论


目前的研究描述了GSF介导的小鼠肝脏代谢组的改变。我们观察到GSF处理后小鼠肝脏中PPIX,N-甲基PPIX,胆汁酸和GSH的显着积累。此外,我们使用代谢组学方法重建了小鼠的GSF代谢,并提供了GSF代谢的完整图谱。我们的数据表明GSF诱导的肝损伤由GSF生物激活引发,其产生GSF-PPIX加合物和N-甲基PPIX。Ñ甲基PPIX强烈抑制PPIX转化为血红素和导致累积PPIX。GSF的反应性代谢产物和高水平的PPIX可直接导致肝损伤。此外,肝脏中过量的PPIX导致胆管阻塞并扰乱异生素和内生素(如胆汁酸)的体内平衡,这反过来又可加强GSF介导的肝损伤(图7)。

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总的来说,本研究提供了GSF诱导的小鼠肝损伤的代谢组学观点。研究数据表明,由于PPIX介导的胆管阻塞,GSF的肝毒性可能由GSF的活性代谢物,PPIX的积累和在肝脏中积累的内生素引起。


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