非靶向代谢组学

✎ 非靶向代谢组学 

非靶向代谢组学旨在发现具有差异代谢物及其所处代谢途径。它以组学的视角无偏向性地检测所有的内源性小分子代谢物,并在代谢层面发现具有差异的代谢物(潜在的生物标志物)及其所处代谢途径,进而分析和探索引起这种生命现象或病理现象背后的代谢机制。并采用生物信息学手段研究生物体受到扰动(如基因改变或环境变化)后内源性代谢物的整体代谢特征或变化规律。与传统的数个代谢物测定或靶向代谢组学定量相比,全谱代谢组学的特点在于对所有的内源性小分子代谢物(通常是浓度较高的代谢物)同时进行测定,因此得到的代谢物信息更客观全面,从而避免研究的方向性错误。



我们的优势


 无便向性,适用于各类型样本和代谢物;

 大型项目经验丰富,单批次 300 例以上样本项目确保数据质量始终如一;

 适合于复杂基质,单次检测可获得更多代谢物和代谢网络信息;

 自建 3500+ 常见物质标品数据库 + 购买各种商业数据库 + 公共数据库,超过十万种代谢物信息;

 全程人工校对,机器和人工智能辅助,使用保留时间、保留指数、质核比和多级碎片离子信息进行物质定性,结果更准,物质数量更多。



样本量要求


图片关键词


基础数据分析

数据检查


对所有样本的总离子流色谱图(TIC)色谱图进行可视化检查,如图1:     






代谢组学-脂质-代谢流


1  代表性总离子图(TIC)色谱图



数据预处理


将仪器检测得到的原始数据转化为通用格式,然后对质谱数据进行峰匹配、峰对齐和保留时间校正,得到去卷积的质谱数据。然后,对来自于同一个物质的各个峰数据进行归属分析。


多维统计分析


对数据进行后处理,将处理后的数据导入到 SIMCA 软件进行多维统计分析,在软件中首先进行 Pareto 格式化Par scaling和平均中心化mean-centering处理,然后再进行 PCAPLS - DA 和 OPLS - DA 等多维统计分析。

3.1   整体PCA分析和组间PLS-DA分析

采用 SIMCA 软件对整体样本进行 PCA 分析(主成分分析),用于解释和分析各组样本之间的代谢差异。如图2




代谢组学-脂质-代谢流


2  整体PCA分析



对样本进行 PLS - DA 分析(偏最小二乘法判别分析),用于分析组间的差异代谢物信息的显著性,并进行 Permutation test(置换检验),结合模型的 Q2 和 R2Y,验证模型的可靠性。如图3:       




代谢组学-脂质-代谢流

3  组间样本 PLS - DA 分析和 Permutation test



3.2   组间 OPLS - DA 分析和 Volcano Plot 分析

为消除无关噪音信息及准确获得两组样本间的显著性差异代谢物信息,我们采用组间 OPLS - DA(正交偏最小二乘法判别分析)进行分析,进而获得 OPLS - DA 模型和相关值(VIP值),作为下一步进行差异物定性筛选的参考。并可对 OPLS - DA 分析的结果进行 Loading Plot 分析和 S - plot 分析,另外使用R语言平台进行 Volcano Plot(火山图)分析。如图4




代谢组学-脂质-代谢流

4  组间样本 OPLS - DA 分析和 Loading Plot 分析、S - plot 分析和 Volcano Plot 分析



单维统计分析


对数据进行单维统计分析,对数据分别进行 Shapiro Wilk's test、Welch's t Test 和 Wilcoxon Mann - Whitney test (U test)。呈正态分布的变量则采用 Welch's t Test 结果,而呈非正态分布的变量则采用 Wilcoxon Mann-Whitney test 结果,综合得到各变量在各对比组之间的显著性分析结果(p-value)。


差异代谢物定性


多维统计分析(VIP>1结合单维统计(p - value<0.05寻找差异性表达代谢物,采用软件人工结合的方式,使用 RT 和特征M/ZGC - MS)或精确分子量和二级质谱(LC - MS)与数据库进行逐一对比分析,差异性代谢物的定性方法为:搜索自建的标准物质数据库、Fiehn GC / MS Metabolomics RTL LibraryGolm Metabolome DatabaseMetlinHMDBKEGGLipid 和 NIST 等商业数据库。差异物列表示例如表1




Metabolites

p-value

VIP

FC(A/B)

HMDB

KEGG

Pathway (KEGG)

pyruvic acid

2.16E-03

1.71

-0.51

HMDB00243

C00022

Glycolysis / Gluconeogenesis;

Citrate cycle (TCA cycle);

Pentose phosphate pathway

glucose

4.11E-02

1.82

2.65

HMDB00122

C00031

Glycolysis / Gluconeogenesis;

Pentose phosphate pathway;

Galactose metabolism

gluconic acid

1.52E-02

1.63

0.68

HMDB00625

C00257

Pentose phosphate pathway

mannitol

4.11E-02

1.45

1.47

HMDB00765

C00392

Fructose and mannose metabolism

dulcitol

2.16E-03

1.74

3.72

HMDB00107

C01697

Galactose metabolism

galactonic acid

2.16E-03

1.96

2.24

HMDB00565

C00880

Galactose metabolism

ethanolamine

2.16E-03

2.10

1.00

HMDB00149

C00189

Glycerophospholipid metabolism


表1  组间样本差异代谢物示例



相关性分析


6.1   Pearson Correlation分析

为了表征各差异性代谢物之间的(浓度)相关性,我们会对这些物质的定量信息进行 Pearson Correlation 分析。如图5



图片关键词


5  差异性代谢物的相关性矩阵图



6.2   热图分析

为了表示差异物之间的聚类关系,我们会对这些物质的定量信息进行 heatmap(热图分析,如图6  



图片关键词


6  差异性代谢物的热图



代谢通路分析


7.1   代谢通路进行归类分析

我们采用 KEGG 数据库对每个差异代谢物所属的代谢通路进行归类分析,如图7



代谢组学-脂质-代谢流


7  差异性代谢物所属KEGG代谢通路示例



7.2   Metaboanalyst Pathway分析

我们用软件 metaboanalyst 对差异性代谢物进行 pathway analysismetabolome view 如图8所示。



代谢组学-脂质-代谢流


8  差异性代谢物metabolome view



Pathway views 如表2所示,Total 表示该途径所含的代谢物总数,Hits 表示该途径含有差异性代谢物数,-log(p) 表示图8纵坐标值,Impact 表示图8横坐标值。参数如表2


Pathway

Total

Expected

Hits

Raw p

-LOG(p)

Holm adjust

FDR

Impact

Pantothenate and CoA biosynthesis

16

0.39402

2

0.05672

2.8695

1

1

0

Zeatin biosynthesis

16

0.39402

2

0.05672

2.8695

1

1

0

Butanoate metabolism

20

0.49252

2

0.08457

2.4702

1

1

0

Alanine, aspartate and glutamate metabolism

21

0.51715

2

0.09208

2.3851

1

1

0

C5-Branched dibasic acid metabolism

4

0.098505

1

0.09504

2.3534

1

1

0

Citrate cycle (TCA cycle)

20

0.49252

1

0.39526

0.9282

1

1

0

Pyruvate metabolism

20

0.49252

1

0.39526

0.9282

1

1

0.148

Purine metabolism

55

1.3544

2

0.39676

0.9244

1

1

0.065


表2  组间样本的Pathway view









定制化分析


定制化代谢通路分析


们根据客户的实验结果,集合各方面现有成果,进行定制化的代谢通路分析,如图9



代谢组学-脂质-代谢流

图9  定制化代谢通路分析图示例



其他定制分析


如使用 Cytoscape 软件对样本的代谢组、蛋白组、基因组进行关联分析(如图10),包括但不限于多组学关联分析、多平台数据整合分析等根据客户实际需求,我们指定详细的方案进行科学合理的分析。只要是基于代谢组学技术的所有统计分析,我们都可以提供高质量技术服务。



代谢组学-脂质-代谢流


图10  代谢组、蛋白组、基因组进行关联分析示例




文献案例


  • Jin H, Qiao F, Chen L, Gao XF, et al. Serum Metabolomic Signatures of Lymph Node Metastasis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma J.Proteome Res, 2014 





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